文档介绍：乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达
【摘要】目的: 研究乙型肝炎病毒(HBV)多表位基因的在原核载体中的克隆、游离表达及其产物的抗原性。方法: 设计、并合成HBV多表位抗原基因BPT, 克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA, 进而转化Top10大肠杆菌, 阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白(BBPT), 并用Western blot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果: 成功构建了原核表达载体pBAD/BPT, 在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白BBPT, Western blot 检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论: HBV多表位抗原基因的设计是成功的, 其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性, 可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。
【关键词】乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗
乙肝是严重危害人类健康的疾病之一, 但目前的乙肝治疗药物如IFNα和拉米夫定(lamivudine)疗效都不很理想。治疗性疫苗作为一种新的治疗途经, 是乙肝治疗的理想方向之一。我们基于HBV表位的现有资料及前期工作, 从HBV基因组中筛选出5个高度保守的HLA识别表位肽, 串连拼接成乙型肝炎多表位抗原基因, 并在大肠杆菌中得到克隆表达。
1 材料和方法
材料质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL21、 Top10由南方医科大学分子生物学院保存。T4连接酶购自Promega公司, IPTG及T载体购自天象人生物工程公司, DNA标志物及限制性内切酶EcoR I、 BamH I购自华美生物工程公司, HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。复合多表位抗原基因片段的选择见文献[1]。引物合成由上海生工生物工程公司合成, 浓度2OD
/管, 工作浓度6 μmol/L。
方法
HBV复合多价抗原基因的设计与合成参照文献[1]。
基因的克隆及阳性重组子的筛选根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征, 设计两端带有Nco I和EcoR I酶切位点的引物: 5′ATGGCAATGCAGTG 3′(上游引入Nco I酶切位点); 5′GCGAAT AGACGAGCTAC3′(下游引入EcoR I酶切位点)。以CAG176为模板[1], PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件: 94℃变性5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 55 s, 扩增30个循环, 最后72℃延长10 min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收, 与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α, 涂板培养, 挑取单菌落培养, 抽提质粒T/BPT, 以Nco I和EcoR I酶切T/BPT及载体pBAD, 冻融法回收小片段和大片段, 两者15℃连接过夜, 转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养。挑取单菌落抽提质粒, 以Nco I和EcoR I双酶切, 并以该质粒为模板, 上述引物和PCR扩增条件进行扩增, 酶切产物及扩增产物均以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 以筛选出阳性重组子。
BPT原核表达载体的构建和表达筛选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养, 挑取单菌落在LB培养基中培养过夜后, 按1%接种量接种到2 mL LB