文档介绍：PCR┐微孔板反向杂交法检测TB┐DNA
作者:李敏苏明权易忠群马越云王其琳丁振若
【关键词】结核分枝杆菌
关键词: 结核分枝杆菌;聚合酶链反应;微孔板杂交
0 引言
结核杆菌感染仍是当今世界范围内危害人类健康的严重问题,,结核病的确诊手段主要依据实验室方法进行,其方法有直接涂片染色抗酸杆菌与结核菌的培养与鉴定,但直接涂片染色阳性率低,且不易于确诊,培养法时间长,(PCR)技术,作为结核菌的非培养诊断技术,其特异性,敏感性,,使检测结果易出现假阳性及假阴性,,采用微孔板反向杂交法,对PCR扩增产物进行液相杂交分析,以进一步提高检测结果的特异性和敏感性.
1 材料和方法
引物选自结核分枝杆菌染色体基因,扩增片段长度为:123bp[1] ,TB1
5’-CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG-3’,TB2 5’-CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG-3’,探针 5’-GCC CAG TGC GAC ACA-3’在合成时TB15’端标记生物素,TB25’,其中痰液标本30份,:10×PCR缓冲液,4×dNTP,引物,:聚蔗糖400,,聚乙烯吡咯烷酮(PVP),,,20×,1mol・L-1 HCl375mL,(∶150稀释成酶应用液),:-,10g・L-1 ,300ml・L-1 ::2mol・L-1 :・L-1 [2] :取晨痰1mL于无菌试管内,加3g・L-1 胰酶缓冲液1mL,煮沸30min,600g离心5min,[3] :取脑脊液100μL,800g离心10min,去上清,沉淀加50μL裂解液,煮沸15min,800g离心5min,:反应总体积为50μL,10×PCR缓冲液5μL,4×dNTP(200μmol・L-1 )6μL,引物(・μL-1 ),无菌去离子水32μL,模板5μL,Taq DNA聚合酶1U・μL-1 ,以无菌石蜡油30μL覆盖,进入PCR循环,循环参数为:95℃5min,94℃1min,60℃1min,72℃1min,32个循环,最后72℃,以20g・L-1 琼脂糖(含EB液)上100V电泳30min,于紫外线下观察结果,出现目的扩增带者为阳性,未见目的扩增带为