文档介绍：新型固定化铁离子亲和色谱整体柱的制备及评价
作者:张丽媛王晖梁振单亦初张丽华张玉奎
【摘要】以N丙烯酰氧基琥珀酰亚胺为功能单体,制备了含有高活性基团的整体材料基质。以次氨基三乙酸为配体,通过固载Fe3+,发展了一种固定化Fe3+亲和色谱(FeIMAC)整体柱的制备方法。该整体柱不仅对磷酸化肽具有很好的选择性,而且富集容量大、回收率高、重现性好。此外,利用该整体柱实现了牛奶蛋白质酶解产物中磷酸化肽段的选择性富集。本实验研制的FeIMAC整体柱有望用于磷酸化蛋白质组研究。
【关键词】固定化金属离子亲和色谱; 磷酸化肽; 选择性富集; 整体柱; 铁
1 引言
蛋白质磷酸化修饰在信号传导、代谢调节、细胞功能调控等生命活动中发挥着重要作用[1,2]。然而磷酸化蛋白/肽通常含量较低,且在质谱分析中易受到大量非磷酸化蛋白/肽的干扰,因此发展针对磷酸化肽选择性富集的新材料对于深入开展磷酸化蛋白质组研究至关重要[3]。
固定化金属亲和色谱(IMAC)是目前最常用的磷酸化富集技术之一。通常利用Fe3+, Ti4+, Zr4+, Ga3+等金属离子与次氨基三乙酸(NTA)的螯合作用来实现金属离子在硅胶、树脂或琼脂糖等基质材料上的固载,并通过金属离子与磷酸化肽中PO3-4的螯合作用,实现磷酸化肽的选择性富集[4~10]。在上述基质材料中,硅胶具有较好的机械性能,但耐酸碱性差;树脂和琼脂糖适用的pH范围较宽,但机械强度差。此外,颗粒基质相对整体材料基质而言,传质速度慢,背压较大[11~13]。因此,发展基于耐酸碱性和生物兼容性好的新型IMAC聚合物整体材料对于提高磷酸化肽的选择性富集能力具有重要意义。
本研究以具有高活性的琥珀酰亚胺官能团的聚合物整体材料为基质,以NTA为配体,通过固载Fe3+,发展了一种新型IMAC整体材料的制备方法。本方法不仅操作简单, 时间短, 制备材料的重现性高,而且通过对磷酸化和非磷酸化混合物,以及牛奶蛋白酶解产物的分析,显示出较高的磷酸化肽选择性富集能力。
2 实验部分
仪器与试剂
JSM6360LV扫描电镜(SEM,日本Jeol公司);Ultraflex III MALDITOF/TOF MS(德国Bruker 公司)。N,N二羧基甲基L赖氨酸(ABNTA)、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、3(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)、2,5二羟基苯甲酸(DHB)(美国Sigma公司);N丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)、癸醇(1Decanol)购于德国Fluka化学公司; 乙腈(色谱纯,Merck公司);偶氮二异丁腈(AIBN)、甲酸(FA)、三氯化铁等均为国产分析纯试剂;磷酸化肽GTpYGV、GTYGVYKVPQLEIVPNpSAEER和非磷酸化肽GTYGV(纯度≥95%,上海吉尔生化有限公司);熔融石英毛细管(530 μm ., 690 μm .,邯郸鑫诺光纤色谱有限公司);实验用水均经过MiliQ水处理系统(美国Millipore公司)处理。
实验方法
FeIMAC整体柱的制备将环己醇、∶∶15配制三元致孔剂。将NAS、EDMA和三元致孔剂按16∶24