土壤总DNA的几种提取方法.doc

文档介绍：SDS高盐法(方案1) 具体步骤:称取1g土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3次,使土壤颗粒研成粉末;([pH=],[],-HCl[],,%CTAB)和50μl蛋白酶K(10g/L)与5g土壤置于50ml的离心管中,放入37℃恒温摇床上,225r·min-1振荡30min;%SDS,轻轻混匀,65℃水浴加热2h,每隔15~30min轻轻摇匀1次;5000r·min-1离心10min,将上清液转入新的50ml离心管中;,摇匀泥浆,%SDS,65℃水浴15min,用上述同样的离心速度离心10min,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1次;用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000r·min-1离心20min;收集上清液,,室温静置1h;25℃下12000r·min-1离心20min,倒出上清液,干燥后加入500μl去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA及其杂质,(方案2)具体步骤:取1g土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1ml变性剂(4mol/L异硫青酸胍,10mmol/LTris-HCl[],1mmol/LEDTA[],%2-巯基乙醇);液氮冰冻,研磨至溶解,重复3次;转入50ml离心管中,加入9ml提取缓冲液([],Tris-HCl[],[],,1%CTAB,2%SDS);65℃水浴1h,每10min轻轻混匀1次;5000r·min-1离心10min,取上清;在原管中加入5ml提取缓冲液,混合后,65℃水浴10min,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5000r·min-1离心20min,取上清;,室温沉淀1h;20~25℃,12000r·min-1离心20min,-酚氯仿抽提法(方案3)称取1g土壤样品,,玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg,,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125ul20%SDS振荡处理15min,离心,分装EP管,加酚(1:1体积),抽提1次,氯仿-异戊醇(1:1体积),抽提2次,,室温放置1h,离心,70%乙醇清洗,200UlTE溶解。冻融溶菌酶SDS裂解法(方案4)取1g土壤样品,(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,200mmol/LNaCl,%PVP,%CTAB,),加玻璃珠旋涡5~10min,在液氮中冷却1min后迅速在沸水中煮2min,如此重复3次,13000r/min离心10min。上清夜快速置于冰上备用,沉淀用于进一步裂解。,旋涡10min,加入溶菌酶(100ml