文档介绍：广州医学院
博士学位论文
Fmr1 基因敲除小鼠海马组织 miRNA 的差异表达及其靶基因鉴
定
姓名:肖都
申请学位级别:博士
专业:内科学
指导教师:易咏红
2011-06
广州医学院博士学位论文脆性 X 综合征小鼠 miRNA 表达谱分析及靶基因鉴定
Fmr1 基因敲除小鼠海马组织 miRNA 的差异表达
及其靶基因鉴定
专业:神经病学
研究生:肖都
导师:易咏红教授
中文摘要
MicroRNAs (miRNAs)是短(约 22 个核苷酸)非编码 RNAs,其调节转录后基
因沉默[1;2 ]。miRNAs 通常通过不完全碱基配对在 mRNAs 3'未翻译区(UTR)结合
它们的靶 mRNAs 并通过抑制 mRNA 翻译或通过促进 mRNA 降解来影响蛋白
表达,参与细胞分化、增殖、凋亡以及各个组织器官正常发育的过程。在哺乳
动物中,发现了数百种不同 miRNAs,包括那些选择性地表达在大脑中的
miRNAs[3]。然而仅少量 miRNA 的靶基因已确认并且在体内证明功能上是重要的
[7]。现有研究表明 miRNAs 在发育早期[4]和疾病例如癌症[5]以及神经变性[6]中起
重要作用,在哺乳动物中,miR-132 通过靶基因 p250GAP 调控树突棘发育[8; 9],
miR-134 和 miR-138 分别通过抑制 LIMK1 和 APT1 参与树状棘发育[10; 11]。
脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是遗传性智力低下最常见的原因[12; 13]
之一,公认的病理改变为不成熟的树突棘,这种不成熟树突棘导致突触可塑性异
常被认为是FXS 发病机制的核心[22; 23]。FXS是FMR1 基因三核苷酸重复序列不
稳定扩增导致脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)
表达的转录沉默所致。既往研究已表明FMRP 是一种RNA 结合蛋白,可抑制某
些与树突棘发育和突触可塑性相关的mRNA 翻译和蛋白质合成。由于FMRP 与
miRNA 同样具有翻译抑制活性,脆性X综合征因此也成为RNAi研究中最早与人
类疾病相联系的疾病之一。FMRP 在生物化学和遗传学上与miRNA通路联系。
虽然FMRP 与RNA 干扰沉默复合体(RISC)中的蛋白(例如Argonaute和Dicer)以
及miRNAs相互作用,但是FMRP本身对RNAi 介导的mRNA 降解并非必不可少
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广州医学院博士学位论文脆性 X 综合征小鼠 miRNA 表达谱分析及靶基因鉴定
[14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21]。FMRP与miRNA关系、以及miRNA在FXS发病机制中的作用
尚待明确。
本课题采用miRNA芯片技术比较正常小鼠及Fmr1 敲除小鼠脑组织miRNA
表达谱,并予Real-time PCR验证差异表达的miRNAs,进一步应用生物信息学软
件预测这些miRNAs与树状棘发育和突触可塑性相关的靶基因,探讨这些
miRNAs在FXS发病中的分子机制。本课题对FMRP-miRNA 相互作用机制的研
究,有望为阐明FXS的发病机制提供新的思路。
材料与方法:
取 FVB 品系 1 周龄雄性 Fmr1 基因敲除小鼠( Fmr1 knockout mouse KO,
KO1W)海马组织用于研究,并采用同龄野生雄性小鼠(wild type mouse WT,
WT1W)作对照。实验前取尾部提取 DNA,PCR 技术进行基因型鉴定。
KO小鼠和WT小鼠各3只。腹腔注射1%戊巴比妥钠(sodium pentobarbital,
- ml)麻醉动物,快速断头取脑,在冰台上取出脑组织分离海马,海马组
织用1ml RNALater 保存。每只小鼠做一次miRNA 芯片的技术重复,共计12张
miRNA 芯片。差异miRNA 筛选标准:q-value(%)=5,同时差异倍数即Fold Change
,样本数=3,Ratio=KO / WT。
结果:
1. Fmr1 基因敲除小鼠和野生小鼠海马组织中miRNA 的表达
标本数 n=3 时(12 张芯片聚类分析时)可获得表达上调的 miRNA 8个(详见
Excel 1),无表达下调的 miRNA;标本数 n=3 时两个样品聚类异常,因此重新
聚类。标本数 n=2 时(8 张芯片聚类分析时)可获得表达上调的 miRNA 56 个(详
见 Excel 2),表达下调的 miRNA 20 个(详见 Excel 2