文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
MiR-155调控T细胞活化的机制研究
姓名:刘永安
申请学位级别:博士
专业:内科学
指导教师:修清玉
2011-05
MiR-155 调控 T 细胞活化的机制研究
摘要
【研究背景和目的】:
哮喘是严重危害人类健康的常见慢性呼吸道疾病之一,近年来其发病率呈逐年增
加趋势,目前尚无有效根治方法。近年来研究认为:哮喘是一种复杂的异质性疾病,
其主要病理特征是气道慢性炎症,其发病的核心机制之一是在炎症反应过程中
CD4+T 淋巴细胞活化异常,Th2 反应增强,导致细胞因子失衡;但具体调控机理尚
未完全阐明。
Bic/miR-155 基因敲除小鼠 CD4+T 细胞活化出现了异常,T 细胞反应明显减弱;
被破伤风抗毒素( Tetc)免疫的该小鼠的脾脏细胞在体外 Tetc 刺激的过程中不能产生
特异的 IL-2 和 IFN-γ;且该小鼠在饲养 320 天之后出现了与哮喘患者类似的气道重
塑。这提示 miR-155 的缺失能够造成细胞因子失衡并可能与哮喘的发病有关。然而
Bic/miR-155 基因敲除导致 IL-2 减少的作用机制尚未得到阐明。
由于 IL-2 主要由 T 细胞在活化过程中产生,T 细胞的活化需要 TCR 及共刺激分
子双信号的参与,我们认为 IL-2 产生的减少可能是由于 bic/ miR-155 敲除的 T 细胞
高表达了负向共刺激分子。BTLA 和 CTLA-4 作为两个非常重要的 Ig 超家族的共抑
制受体,均被证明能够在 CD4+T 细胞活化过程中起到重要的负性调节作用;相关研
究表明 CTLA-4 基因的多态性与哮喘的发生关系密切,BTLA 也能够调节肺脏 T 细胞
的生存从而调节气道炎症的持续时间;因此 CTLA-4、BTLA 均有可能是 miR-155 调
控 T 细胞活化并参与哮喘发病的重要靶标。
为了验证 BTLA、CTLA-4 是否为 miR-155 在 T 细胞活化中的功能靶标,我们设
计了该实验。
【实验方法】
首先:通过权威预测软件 TargetScan、miRanda 和 Pictar 明确 BTLA 和 CTLA-4
3’-UTR 是否存在 miR-155 的结合位点。
然后在确认存在结合位点的基础上,通过双荧光素酶报告基因实验验证 miR-155
对靶标 3’-UTR 有无直接抑制作用。分别构建含 BTLA 3’-UTR 全长和 CTLA-4 3’-UTR
全长的双荧光素酶报告基因载体:分别从小鼠基因组中扩增出其 3’非编码区(UTR)
全长,设计引物将其与目标载体(pEZX-MT01)定向连接,转化细菌感受态细胞,
PCR 鉴定阳性克隆并测序。利用测序验证 3’-UTR 报告基因载体克隆成功;转染细胞:
利用 Fugene HD 随机将含靶标 3’-UTR 质粒载体与或空质粒载体分别与 miR-155
mimics 或 mimics 阴性对照共转染至 HEK293T 细胞,孵育 24 小时后分别收集细胞。
与海肾荧光素酶报告基因的活性相比较,通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各
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组细胞萤火虫荧光素酶的相对活性。
再次在明确 miR-155 能够调控靶基因 3’-UTR 的基础上,首先观察基础状态的
naïve CD4+T 细胞活化前后 miR-155 及靶标分子的表达变化;然后观察 miR-155 在
CD4+T 细胞中对靶标是否具有转录后调控作用。用淋巴细胞分离液分离小鼠淋巴细
胞,将其随机分为两组,分别通过 NucleofectorTM 电转染的方法将 miR-155 inhibitor 或
inhibitor 阴性对照转染至淋巴细胞中。16 小时之后通过免疫磁珠分选的方法分选各
组的 naïve CD4+T 细胞。将分选后的细胞通过抗 CD3、抗 CD28 双抗体进行体外活化
培养;流式细胞仪检测各组活化细胞的细胞表面分子的表达率,Real-time RT-PCR 检
测各组细胞相关基因的表达,Elisa 检测细胞上清中 IL-2 的表达。
【实验结果】
(1)TargetScan 和 miRanda 均预测 BTLA、CTLA-4 为 miR-155 的靶点,成功构
建含小鼠 BTLA 3’-UTR 或 CTLA-4 3’-UTR 全长的双荧光素酶报告基因载体。
(2)双荧光素酶报告基因荧光素酶活性检测结果为:与阴性对照和 3’-UTR 全长
载体共转染相比较,miR-155 mimics 与 BTLA 3’-UTR 全长或 CTLA-4 3’-UTR 全长共