文档介绍：无菌检查方法的验证无菌检查方法的验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法,是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要,而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础,因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求,2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高,同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。验证要求与方法无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。前验证,也称预验证,指在无菌分析方法正式使用前,按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由,任何检查方法必须进行前验证。再验证,指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的,旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。通常一个无菌产品的检查流程为:首先基于产品的剂型、溶解度等性质,按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性,确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。这里,验证的重点环节包括: 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性,应是验证的重点。供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点,尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。具体的验证方法如下: 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株,它们分别代表不同类型的菌种:枯草芽孢杆菌[(B)63501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[(B)26003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[(B)64941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[(B)44102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[(F)98001]代表酵母菌、黑曲霉菌[(F)98003]代表霉菌。菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,23~28℃培养24~48h,%无菌***化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~%(ml/ml)%无菌***化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,%(ml/ml)%无菌***化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。样品的前处理无菌产品中每个成分应该是均匀的,因此只要确定在验证的方法中,按所需的总接种量即可,而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂,需要确保这些溶剂是有效的,并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时,需要确保加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。不需前处理的样品免做。消除样品抑菌性的方法无抑菌性样品的验证方法:依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释,用直接接种法验证,常用中性稀释液或淋洗液。对于具有抑菌性样品的验证方法,首先确定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌试验验证),选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查(阳性菌回收试验)。常用的消除样品抑菌活性的方法如下: 稀释法:利用降低供试品的相对浓度,将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如:取规定量的样品溶液至较大量的培养基中,使单位体积内的样品含量减少,至不含抑菌作用。薄膜过滤法:利用体积差异分离,通过薄膜过滤,微生物被截于滤膜,培养薄膜观察有无微生物生长。,直径一般为50?mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。供试液经过滤膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100?ml。总冲洗量不得超过1000ml。化学中和法:利用化学(生物)专属性灭活,常用中和剂或灭活方法有:对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品,用酶中和,如β-内酰***酶。联合使用:将以上两种或几种方法组合运用,以消除样品的抑菌性。适用于抑菌作用较强的中西药制剂。其次按照以下要求制备3组样品: 样品组:选择以上适当