文档介绍：刚果红与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究
01应用化学: 翟萌
指导老师: 吴霞
前言
蛋白质作为生命活动的物质基础,其定量分析在生物学,医学及其营养科学等领域中具有重要意义。蛋白质含量的分析方法很多,目前应用最广,操作较为简便的分子光谱分析方法有吸光光度法,荧光光谱法以及新近发展的共振光散射分析法。
荧光光谱法是研究生物大分子, 特别是蛋白质与各种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手段。通过对荧光特征峰及其在不同条件下的位移情况、荧光偏振、同步荧光、能量转移效率、荧光寿命、荧光猝灭、荧光增强等的研究, 可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息, 同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。
本文通过荧光光谱技术,研究刚果红与牛血清蛋白(BSA)在表面活性剂TX-100存在下的相互作用,探讨刚果红与BSA作用的机制,测定其荧光猝灭常数、刚果红与BSA作用的结合常数和结合力。
刚果红在非离子表面活性剂TX-100存在下对BSA荧光猝灭的作用
×104g·mL-,用微量注射器(范围:1~10μL)逐次加入1μL的CR-TX-100混合溶液进行荧光滴定,每次加入溶液后混合均匀,分别在室温(16℃)和恒温37℃下作用20min,以279nm为激发波长,在荧光分光光度计上记录300-450nm波长范围内的发射光谱。
图1 BSA随CR-TX-100浓度变化的荧光光谱
若将CR-TX-100混合溶液对BSA荧光的猝灭归因于分子碰撞引起的动态猝灭, 按照Stern-Volmer方程:
F0/F =1+Kqτ0 [CR] = 1+Ksv[CR]
Ksv = Kqτ0。由于CR-TX-100混合溶液的累积体积为10μL , %,所以可忽略滴定过程中的体积变化。以F0/F 对[CR ]绘图, 得到右图
图 2常温(16℃)时CR-TX-100与 BSA的Stern-Volmer图
由上图可以求出室温下Ksv=×105(mol·L-1 ) -1, 由于生物大分子荧光平均寿命大约为10-8s ,×1013 (mol·L-1 )-1·s-1, ×1010 (mol·L-1)-1·s-1。显然,刚果红对BSA 荧光猝灭的过程速率远大于扩散控制的Kq , 由此可以推断, 猝灭过程主要为静态猝灭。
在静态猝灭中,静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系有:
(F0-F)-1=F0-1+ F0-1K-1[CR]-1。
以(F0-F)-1对[CR]-1绘图,得到右图
37℃
16℃
温度/℃
Kq(BSA)/(L·(mol·s-1))
K(BSA)/(L·mol-1)
16
×1013
×106
37
×1014
×105
表1不同温度下CR-TX-100与BSA的猝灭速率常数和结合常数
图3不同温度CR-TX-100与BSA的Lineweaver-Burk图
当温度变化不大时,反应焓变ΔH可以看作是一个常数,
由㏑(K2/K1)= ΔH/R(1/T1-1/T2);ΔG=ΔH-TΔS; ΔG=-RT㏑K;
可以求出反应焓变ΔH为-;
熵变ΔS为-/(mol·K),即ΔH﹤0, ΔS﹤0 。
ΔH
ΔS
结合力类型
﹥0
﹥0
疏水作用力
﹤0
﹥0
静电引力
﹤0
﹤0
范德华力
表2 结合力与热力学参数的关系
ΔH﹤0, ΔS﹤0,根据热力学参数与作用力的关系,可知刚果红与BSA结合的作用力类型主要是范德华力
生理条件下刚果红在TX-100存在下对BSA的荧光猝灭
×10-3g·mL-1的BSA,%的NaCl溶液,=-HCl缓冲溶液,用水稀释至10mL,摇匀,分别在室温和恒温37摄氏度下,,用微量注射器依次加入1μL的CR-TX-100混合溶液(CR:TX-100=1:25,CR=×10-4 mol·L-1),每次加入溶液后混合均匀,以279nm为激发波长,在荧光分光光度计上记录300-450nm波长范围内的发射光谱。
图4 生理条件下刚果红在TX-100存在下对BSA的荧光猝灭
图5 生理条件下不同温度时CR-TX-100与 BSA的Stern-Volmer图
图6 生理条件下不同温度CR-TX-100与BSA的Lineweaver-Burk图
37 ℃
18 ℃