凝胶电泳.doc

文档介绍：(1)30%丙烯酰***(Acr):称Acr30g,甲叉双丙烯酰***(Bis),加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中,4℃贮存可用1-2月。(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)(3)-HCl缓冲液:,加入50ml水,用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml。(4)-HCl缓冲液:,加入50ml水,用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml。(5)-HCl缓冲液:,加入50ml水,用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml。(7)10%过硫酸铵(AP)(8)TEMED(四***乙二***)(9)样品溶解液:SDS(100mg)+巯基乙醇()+溴酚蓝(2mg)+甘油(2g)+-HCl(2ml),最后定容至10ml。(10)固定液:取50%甲醇454ml,冰乙酸46ml混匀。(11)染色液:,加上述固定液250ml,过滤后备用。(12)脱色液:冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸馏水定容至1000ml。(13)电极缓冲液(%SDS,-):,,加入SDS1g,加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。,.※固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,,避免产生气泡.※水封的目的是为了使分离胶上延平直,并排除气泡※,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖.※要使锯齿孔内的气泡全部排出,、加样三个。(1)取10μl标准蛋白溶解液于EP管内,再加入10μl2倍样品缓冲液,上样量为20μl。(2)取10μl样品1溶液,再加入10μl2倍样品缓冲液,上样量分别为5μl和10μl。,加样前,样品在沸水中加热3分钟,去掉亚稳态聚合。※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.※为避免边缘效应,,接通电源,进行电泳,开始电流恒定在10mA,当进入分离胶后改为20mA,溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳。:电泳结束后,撬开玻璃板,将凝胶板做好标记后放在大培养皿内,加入染色液,染色1小时左右。:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清晰。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.