文档介绍：一、含义二、优越性三、应用四、定量方法五、荧光材料六、结果分析一、含义实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。二、优越性特异性荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性,故与传统的PCR相比,特异性大为提高。敏感性荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分析,线性范围很宽,为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝,在此范围内荧光定量PCR定量较为准确,标本不需稀释。重复性荧光定量PCR结果相当稳定,,各反应组分浓度相对稳定,没有副作用,CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定,更精确地反映起始模板的拷贝数。自动化无PCR后续操作步骤,降低产物污染的风险性。三、应用用于核酸的定量如RNA、DNA的定量用于核酸定性分析如SNP分析,基因型分析,RNA变异分析,溶解曲线分析等。四、定量方法1.  标准曲线法的绝对定量2.  标准曲线法的相对定量 3.  比较CT法的相对定量SYBRgreenI未结合的SYBRgreenI水解探针TaqMan荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYL探针与目标序列配对时,发生荧光共振能量转移(FRET)光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时,Taq酶水解探针,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光,形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光分子信标荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补淬灭剂茎(5-7bp)环(15-30bp)FAMTexasRed