文档介绍：---------------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________生化实验讲义:实验九--酵母蔗糖酶实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践机会,学****如何提取纯化、分析鉴定一种酶,并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究。ycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来,它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase)(b—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranosidefructohydrolase)()特异地催化非还原糖中的a—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶(externalyeastinvertase),其活力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶(internalyeastinvertase),含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它们的分子量也不同,外酶约为27万(或22万,与酵母的来源有关),。尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要是外酶。两种酶的性质对照表如下:名称MW糖含量亚基底物为蔗糖的Km底物为棉子糖的Km等电点pI最适pH稳定pH范围最适温度外酶27万(22万)50%(~)~℃<3%(~)~,用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度,在给定的实验条件下,每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。本实验共有九个分实验:一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定八、尿素(脲)抑制蔗糖酶的实验九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验(一)蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的:学****酶的纯化方法,并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。二、试剂:(使用前预冷到0℃以下)(使用前冷至4℃左右)、%乙醇三、仪器:、操作步骤:(1)准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中。(2)称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母,称20mg蜗牛酶及适量(约10g)二氧化硅,放入研钵中。二氧化硅要予先研细。(3)量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中,边加边研磨成糊状,约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果,至酵母细胞大部分研碎。(4)缓慢加入预冷的40ml去离子水,每次加2ml左右,边加边研磨,至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。(5)将混合物转入两个离心管中,平衡后,用高速冷离心机离心,4℃,10000rpm,10min。如果中间白色的脂肪层厚,说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。(6)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相,转入另一个清洁的离心管中,4℃,10000rpm,离心10min。(7)将清液转入量筒,量出体积,。剩余部分转入清洁离心管中。(8)用广泛pH试纸检查清液pH,,称为“粗级分I”。(1)予先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中,50℃下保温30分钟,在保温过程中不断轻摇离心管。(2)取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,10000rpm,离心10min。(3)将上清液转入量筒,量出体积,(称为“热级分II”)。,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟,以沉淀完全。于4℃,10000rpm,离心10min,倾去上清,并滴干