文档介绍：货号:QS1103                          规格:50管/48样胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)试剂盒说明书紫外分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:ICDHc()广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-***戊二酸,同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。测定原理:利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应,在340nm下测定NADPH浓度的增加。自备实验用品及仪器:紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制:提取液:60mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存;试剂二:粉剂×1支,4℃保存;试剂三:粉剂×1支,4℃保存;试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;样本的前处理:1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、血清(浆)样品:直接检测。测定步骤:1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂4℃保存。3、在试剂三中加入550μL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。4、在试剂四中加入550μL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。5、操作表:试剂名称(μL)测定管试剂一750试剂三10试剂四10样本30  将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中,加样本的同时开始计时;混匀,在340nm波长下记录20s时的初始吸光度A1和2min20s时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。注意事项:1、若A2-,需将酶液用提取液稀释,使A2-,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。2、若A2-,可延长反应时间到5min或10min。ICDHc活力单位的计算:1、血清(浆)ICDHc活力的计算:单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmol/min/mL)