文档介绍：不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNAITS序列解析本文从网络收集而来,上传到平台为了帮到更多的人,如果您需要使用本文档,请点击下载按钮下载本文档(有偿下载),另外祝您生活愉快,工作顺利,万事如意! 当归为常用中药,始载于《神农本草经》,列为中品。来源为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。目前主要分布在甘肃、云南、四川、湖北、陕西等地。当归的野生资源由于过度采挖已经濒临枯竭。笔者通过当归的种质资源调查,发现当归有紫茎和绿茎之分。另外,四川等地栽种有东当归Angelicaacutiloba(.)Kitagawa,东当归又称日本当归,在日本作为当归入药。在西藏林芝等地,还有野生的牡丹叶当归(Yuan),在西藏林芝等地也多将牡丹叶当归的根作为当归入药。随着分子生物学技术的发展,出现了一些新的中药鉴别方法。PCR直接测序法是20世纪90年代迅速发展起来的测序技术,具有快速、灵敏、准确率高等特点。其中核糖体DNA中的内转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)序列的进化速率较快,可用于解决属下不同种和种内的系统发育和分类问题。近几年,该技术在中药材的鉴别中得到一定的应用。本研究通过对14个不同种质和表型的当归及其地方习惯用品东当归、牡丹叶当归的ITS序列进行测序和分析,探讨该片段在中药当归分子生物学水平上的鉴定意义。 1材料与方法材料 ITS测序序列样品来自14个当归和习用品牡丹叶当归和东当归的新鲜嫩叶。 DNA提取新鲜植物叶片,参照Rodrigues组织培养表面消毒的方法处理后各g,加液氮研磨成细粉后,使用改良的CTAB法提取总DNA,于-20℃保存备用。 PCR扩增和产物纯化 PCR扩增引物为真核ITS扩增专用产物LH2、ITS4。引物均由上海生工生物工程有限公司合成,序列为LH2:5′-TGCG-GAAGGATCA-3′;ITS4:5′-GCTTATTGATATGC-3′。反应液(以20μL/L反应体积为例):10×PCRbuffer2μL,10mmol·L-1dNTPμL,Mg2+(25mmol·L-1)μL,引物LH2和ITS4(10μmol·L-1)各1μL,Taq酶(5U·μL-1)μL,DNA模板(适宜浓度)2μL,灭菌三蒸水(3dH2O)10μL。PCR扩增条件为94℃变性4min,94℃1min,50℃2min,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min,以灭菌三蒸水代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用QIAGENPCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。 PCR产物ITS序列的测定纯化后的PCR产物作为测序反应的模板,PCR反应的引物直接作为测序引物,采用双脱氧终止法终端荧光标记,进行DNA序列的正向和反向测定。测序反应在ABI377测序仪上进行。所得序列用CLUSTALX(Version)进行多重比对,编辑和校正多重比对结果用BioEdit;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构和EMBL和Gen-Bank上的参考序列。 2结果根据GenBank中的当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的ITS序列(Genebank:)确定当归和东当归、牡丹叶当归的rD