文档介绍：不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的 rDNA ITS 序列解析当归为常用中药, 始载于《神农本草经》, 列为中品。来源为伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根。有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。目前主要分布在甘肃、云南、四川、湖北、陕西等地。当归的野生资源由于过度采挖已经濒临枯竭。笔者通过当归的种质资源调查,发现当归有紫茎和绿茎之分。另外, 四川等地栽种有东当归 Angelicaacutiloba ( .) Kitagawa , 东当归又称日本当归, 在日本作为当归入药。在西藏林芝等地,还有野生的牡丹叶当归(Angelica paeoniifolia Shan et Yuan) ,在西藏林芝等地也多将牡丹叶当归的根作为当归入药。随着分子生物学技术的发展,出现了一些新的中药鉴别方法。 PCR 直接测序法是 20 世纪 90 年代迅速发展起来的测序技术, 具有快速、灵敏、准确率高等特点。其中核糖体 DNA 中的内转录间隔区(internal transcribed spacer , ITS) 序列的进化速率较快,可用于解决属下不同种和种内的系统发育和分类问题。近几年, 该技术在中药材的鉴别中得到一定的应用。本研究通过对 14 个不同种质和表型的当归及其地方习惯用品东当归、牡丹叶当归的 ITS 序列进行测序和分析,探讨该片段在中药当归分子生物学水平上的鉴定意义。 1 材料与方法 材料 ITS 测序序列样品来自 14 个当归和习用品牡丹叶当归和东当归的新鲜嫩叶。 DNA 提取新鲜植物叶片, 参照 Rodrigues 组织培养表面消毒的方法处理后各 g ,加液氮研磨成细粉后,使用改良的 CTAB 法提取总 DNA , 于-20 ℃保存备用。 PCR 扩增和产物纯化 PCR 扩增引物为真核 ITS 扩增专用产物 LH2 、 ITS4 。引物均由上海生工生物工程有限公司合成, 序列为 LH2 : 5′-GTCGAATTCGTA TGCG-GAAGGATCA-3′;ITS4 : 5′-GCTTATTGATATGC-3′ 。反应液(以 20 μL/L 反应体积为例): 10×PCR buffer 2 μL , 10 mmol · L-1 dNTP μL , Mg2+(25 mmol · L-1) μL ,引物 LH2 和 ITS4(10 μmol · L-1) 各1 μL , Taq 酶(5U· μL-1) μL , DNA 模板( 适宜浓度)2 μL ,灭菌三蒸水(3dH2O)10 μL 。 PCR 扩增条件为 94℃变性 4 min , 94℃1 min , 50℃2 min , 72℃1 min , 循环 30次;72 ℃延伸 10 min ,以灭菌三蒸水代替模板 DNA 作空白对照。扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。用 QIAGENPCR 产物纯化试剂盒进行 PCR 产物的纯化。 PCR 产物 ITS 序列的测定纯化后的 PCR 产物作为测序反应的模板, PCR 反应的引物直接作为测序引物, 采用双