文档介绍：试剂(1)卡诺氏固定液:无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合配制。(2)1mol/L盐酸溶液:取浓盐酸(),。(3)醋酸洋红染液:4-5g洋红,冰醋酸45ml,蒸馏水55ml,先将冰醋酸加入蒸馏水中煮沸,然后将火移去,立刻加入洋红,用玻璃棒搅匀溶化,冷却后过滤即成。(4)70%酒精;95%酒精。(1)发根挑选每份黑麦种子材料25粒,经流水冲洗,放于培养皿内温水浸泡24h。置于25℃恒温箱中发根。待根长到1~2cm时,于适宜时间用蒸馏水洗净,将水吸干,~1cm进行预处理。为获得尽可能多的分裂相,根尖以上午9~10时剪取为宜。(2)预处理为了有利于有丝分裂中,染色体的观察和计数,通常要对材料进行不同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成,来获得更多的中期分裂相,同时还可以改变细胞质的粘度,促使染色体缩短和分散,便于压片和观察。将根尖浸于蒸馏水内,1-4℃低温处理24h。(3)固定材料经预处理后,用流水冲洗2次,然后投入卡诺液(3份甲醇∶1份冰乙酸,现配现用)中固定26h,用95%的乙醇洗两次,转入70%乙醇中保存备用(4℃)。固定的目的是:①迅速防止细胞死亡后的变化,如自溶、***等,尽量保持生长状态结构。②使细胞中的蛋白质、脂肪等成分转变为不容性物质,以保持生前的形态。③使组织内各种物质成分产生不同的折光率,便于观察和鉴定。④使不同组织成分对染料有不同的亲和力,便于染色。⑤防止细胞过度收缩或膨胀,失去原有的形态结构。(4)解离 常用酸解法:从70%乙醇中取出固定好的根尖,用蒸馏水冲洗后,吸水纸吸干,放入盛有1mol/,60℃水浴,恒温条件下解离10min。植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用,分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体,因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离,这一操作称为解离。同时,解离也可适当清除部分细胞质,使细胞质背景趋于透明化,便于观察染色体。通过解离和压片,分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出,使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质,让后续制片处理直接作用于染色体。(5)染色解离后吸出HCL,用蒸馏水水洗2次,每次3-5分钟,将根尖置于载玻片中间,切去根冠,从乳白色分生组织切取尽可能薄的一片,滴加1~2滴品红染液,染色5min。(6)压片 在经染色的材料上加一滴染液,在染液左侧放一刀片,盖上盖玻片,用镊子垂直敲打,先轻轻敲出盖玻片下的空气,然后边敲边向外移动刀片,待刀片移出盖玻片后,覆一层吸水纸,用镊子垂直敲打(注意勿使盖片搓动),待材料分散均匀后,将玻片拿到酒精灯火焰上烤,烤至稍烫手为宜,然后迅速用拇指按住盖玻片,用力压。(7)镜检 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数,因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野,再用高倍镜仔细观察、记数、拍照。调节可调节可变光栏与反光镜,使光线明暗合适,视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化,找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数,对好的分裂图像作上标记,以便再观察。,染色体计数至少观察统计50个完整的中期分裂相。核型分析至少测量5