文档介绍：水体中隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法介绍来源:中法水务隐孢子虫(Cryptosporidium)和甲第鞭毛虫(Giardia)是两种致病性原生动物,可引起人感染患病,分别称为隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)和甲第鞭毛虫病(Giardiasis),其临床主要表现为急性腹泻或霍乱样水泻,可能伴随腹痛、恶心和呕吐等。该病目前尚无安全有效的治疗措施、免疫能力正常的患者一般能在1周至1个月内自行痊愈;但免疫能力缺陷者和儿童感染该病可能因长期腹泻而导致营养不良、脱水、甚至危及生命。近年来的调查研究表明:水和食物污染是隐孢子虫和甲第鞭毛虫的重要传播途径。据不完全统计,自1976年伯温隐孢子虫()被确认为人的病原体以来,美国、英国、加拿大、澳大利亚等许多国家相继都报道了水源性隐孢子虫病和甲第鞭毛病的爆发流行。其中,1993年3至4月份、,导致了40万人受感染。我国自1986年开始有隐孢子虫病的报道,相关调研表明我国隐孢子虫和甲第鞭毛虫分布也比较广泛。近二十年未,隐孢子虫和甲第鞭毛虫的危害引起了国际社会的广泛关注,国环保局(EPA)与有关国家相关部门和科研机构对隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法,水处理工艺和消毒对其去除和灭活,以及如何防止其污染等开展了系统研究。本文就隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法及其活力和感染性的评估两方面作一简要综述。1、ICR、、ICR方法(InformationCollectionRule)该方法用孔径为1μm的纤维缠绕式滤筒过滤来浓缩大量水样,被截留的颗粒物从滤筒中洗脱后,通过离心的方法浓缩,然后利用蔗糖密度梯度离心的方法将生物颗粒与非生物颗粒分开,再用单克隆免疫荧光抗体未标记隐孢子虫和甲第鞭毛虫,以增加其在荧光显微镜检中的检出率。本方法的缺陷是洗脱、浓缩和纯化等步骤容易造成隐孢子虫卵事囊(oocyst)和甲第鞭毛虫包囊(cyst)的损失,从而导致回收率低;镜检依赖于分析人员的经验和专业背景知识,主观性较大;另外,本方法不能确定卵囊的活力和感染性等等。,美国环保局1996年开始采用免疫磁力分离(icSeparation)等新技术对隐孢子虫进行分析监测,提出了单独检测隐孢子虫的1622方法,并于1999年1月将其作为一个正式的检测标准发布。由于甲第鞭毛虫免疫磁力分离系统的建立落后于隐孢子虫,于1998年10月才被认可,因此,EPA于1999年2月才发布能同时检测隐孢子虫和甲第鞭毛虫的检测方法,为将其与1622方法相区别,称其为1623方法。1623方法采用滤筒过滤,免疫磁珠分离和免疫荧光(IFAImmunofluorescentAssay)显微镜检来检测和计数隐孢子虫和甲第鞭毛虫,并借助DAPI染色和微分干涉()显微镜检观察其内部的特征结构来证实卵囊和包囊的存在。以下从过滤、洗脱、离心浓缩、IMS分离纯化、荧光染色、荧光镜检、微分干涉镜检和质量控制等方面介绍1623方法的实验过程。,要求水样在0—8℃保存,24小时内运抵实验室。采用PallGelmanEnviro—checkTM等滤筒过滤浓缩水样,过滤水样流速为2LPM。与ICR方法中使用的滤筒相比,Enviro—check滤筒凭借其1健m滤膜的坡相设计增加了过滤水样体积和截留、复现隐抱于虫和甲第鞭毛虫的效率。,1623方法将滤筒中截获的隐袍子虫和甲第鞭毛虫从滤膜上洗脱下未的方法也大有改进。其在滤筒中加入洗脱缓冲液后,利用摇臂振荡器的水平间歇物理振荡(600rpm)将隐孢子虫和甲第鞭毛虫从滤膜上洗脱下来,提高了回收率。×G离心,弃上清,根据沉淀多少加入适量缓冲液重新悬浮,悬浮液被转移至平边样品管(flat—sidedsampletube)中。、包囊与磁珠抗体结合向悬浮液中加入抗隐孢子虫的磁珠抗体(bo)和抗甲第鞭毛虫的磁珠抗体(bo),抗原抗体反应使卵囊和包囊分别与其磁珠抗体结合,形成复合体。、色囊与杂质的分离卵囊、包囊由于与其磁珠抗体偶联,被磁珠收集器(MCP—1)磁力吸附在样品管壁上、杂质则随上清被去除。卵囊、包囊被转移至微量离心管后在另一个磁珠收集器(MCP—M)上再次被分离纯化。、色囊与磁珠的解离为消除磁珠对卵囊、包囊染色和镜检的干扰,染色前必须将