文档介绍：蛋白纯化答疑Byaqiao发表于2007-4-1518:38:00凝胶过滤层析也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。关键是不知道你用什么凝胶过滤层析。一般来说大部分细菌比蛋白质小,要看是什么的凝胶过滤层析,才能达到材料上的阻挡。响凝胶过滤层析的多种因素很多人以为凝胶过滤非常简单直接,无需花太多精神仔细优化。其实影响凝胶过滤的参数非常多,现与大家分享几点经验:1层析柱必须有柱头及分布器,即adaptor,紧压胶面完合没有空隙,否则样品上样受影响。2凝胶悬浮液不可太稠,否则很容易出气泡;太稀装柱时间过长,亦影响效果。50-70%较适合。若是干粉,溶胀时间必须充足。装前完全搅匀。3一次性倒入层析柱中,容量不够则需加装柱器。切不可分几次倒,柱效和对称性都很难合格。4装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。5柱底网下的气泡一定要除掉,可先用20%乙醇湿一下底网。6每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。跟足介质说明书的指引就万无一失了!找不到查AKTA系统的Unicorn中主屏幕的adviser即可,也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。7上样前柱平衡非常重要,不光UV平稳,至少平衡一个柱体积。8缓冲液pH值会影响分离效果,,结果颇有不同。。如果在适当期间加入不同的材料可以有效的防止对应的细菌。老兄,我新手哈,只能给你这么多的了。这个网站可以稍微帮你点参考,但是得全综合来总结,我就不方便全部总结了!请多支持我哈,个人感觉你的问题太简单了。不好针对性的回答,不可能把所有的情况说出来再分析吧?~!回答者:janefeng1986-试用期一级3-2301:52同意楼上的说法回答者:菜刀狗狗-助理三级3-2518:25一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌?:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施,时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好,我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(D