文档介绍：蛋白纯化答疑 By aqiao 发表于 2007-4-15 18:38:00 凝胶过滤层析也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。关键是不知道你用什么凝胶过滤层析。一般来说大部分细菌比蛋白质小,要看是什么的凝胶过滤层析,才能达到材料上的阻挡。响凝胶过滤层析的多种因素很多人以为凝胶过滤非常简单直接,无需花太多精神仔细优化。其实影响凝胶过滤的参数非常多,现与大家分享几点经验: 1层析柱必须有柱头及分布器,即 adaptor ,紧压胶面完合没有空隙,否则样品上样受影响。 2凝胶悬浮液不可太稠,否则很容易出气泡;太稀装柱时间过长,亦影响效果。 50- 70% 较适合。若是干粉, 溶胀时间必须充足。装前完全搅匀。 3一次性倒入层析柱中,容量不够则需加装柱器。切不可分几次倒,柱效和对称性都很难合格。 4装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。 5柱底网下的气泡一定要除掉,可先用 20% 乙醇湿一下底网。 6每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。跟足介质说明书的指引就万无一失了!找不到查 AKT A 系统的 Unicorn 中主屏幕的 adviser 即可,也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。 7上样前柱平衡非常重要,不光 UV平稳,至少平衡一个柱体积。 8缓冲液 pH值会影响分离效果,经验中用 和 的缓冲液分离 5个低分子量标准蛋白,结果颇有不同。 9加入 NaCl 可防止非特异性的吸附及蛋白间的聚合。如果在适当期间加入不同的材料可以有效的防止对应的细菌。老兄,我新手哈,只能给你这么多的了。 101/2006/ 这个网站可以稍微帮你点参考,但是得全综合来总结,我就不方便全部总结了! 请多支持我哈,个人感觉你的问题太简单了。不好针对性的回答,不可能把所有的情况说出来再分析吧? ~! 回答者: janefeng1986 -试用期一级 3-23 01:52 同意楼上的说法回答者: 菜刀狗狗-助理三级 3-25 18:25 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌? 细胞的破碎方法 :将材料配成稀糊状液,放置于筒内约 1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 :先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。 :用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料, 用大肠杆菌制备各种酶,常选用 50-100 毫克菌体/毫升浓度,在 1KG 至 10KG 频率下处理 10-15 分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施,时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮,如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 :将细胞在-20 度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 :有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠( SDS )、去氧胆酸钠等细胞膜破坏, 细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好,我用的浓度一般为 1mg/ml 。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解, 导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸( DFP )可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物( PMSF )也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择 pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方:裂解液: 50mM Tris-HCl(~), 2mM EDTA, 100mM NaCl, % Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个 pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于 20kd 的话,尽量减少溶菌酶的用量, 60ml ,溶液很粘. protocol 是 10ml-50ml 缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g 湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得 100-200ml 菌就够了. 但凡超声,我都用 60m l裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用 100m l 小烧杯,装 60ml 裂解液,