文档介绍：1、质粒提取及琼脂糖电泳鉴定一、试剂碱法质粒抽提的三种溶液溶液I:50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,-Cl溶液为了控制好溶液的pH。50mM葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,作用是抑制DNase活性和抑制微生物生长。溶液II:%(保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱碱性)和2%的SDS等体积混合。破细胞的主要是碱而不是SDS,所以称碱法抽提。NaOH引起细胞膜从双层膜结构向微囊结构的相变化,因而可使大肠杆菌细胞瞬间溶解。只用SDS也能抽提得到少量质粒,由于SDS的碱性较弱。加SDS的作用是为了第三步。这一步要控制时间不能过长,因为碱性条件下基因组DN***断会慢慢断裂;同时必须温柔混合,不然会引起基因组DNA断裂而带来麻烦。很多人误以为NaOH的作用是为了让基因组DNA变性以便沉淀。溶液III:3M醋酸钾/2M醋酸二、实验步骤1、,12000r/min,30sec。2、倒去吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。3、将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中,剧烈振荡。4、加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧Eppendorf管,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf管放在冰上5min。5、加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。6、12000r/min,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。7、向上清夜加入800μL无水乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。8、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清夜,真空抽干或空气中干燥。9、20μLTE缓冲液,使DNA完全溶解(-20℃保存)质粒DNA酶切及琼脂糖电泳鉴定HindⅢ质粒DNATBE缓冲液(5×):用时需稀释10倍点样缓冲液Loadingbuffer(10×):%溴酚蓝,40%甘油溴乙啶染色液(EB):10mg/ml溴乙啶注意:该试剂具致癌作用,用时要小心。琼脂糖操作步骤(一)、质粒DNA酶切按下表将各种试剂加入Eppendorf管中。质粒DNA8HindⅢ/?(10×)/?l2ddH2O/?,置于37℃水浴中,。然后每个管中迅速加入2?lEDTA终止反应。(二)、×TBE缓冲液中加热熔解。冷却至60℃加入制胶槽中。在一端插好梳子。待凝胶完全凝固后,垂直拔掉梳子,将凝胶槽移至电泳槽。加入的电极缓冲液要高出凝胶面2~3mm。点样:每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer(10×),混匀后小心地加入样品槽中,要避免相互污染。电泳:接通电源,电压为80V,电泳40min左右,当溴酚蓝到达下沿1~2㎝处时,停止电泳。染色:将胶在含有5?g/mL的EB中染色10min。观察及照相:将胶板拿出,用凝胶成像系统照相。2、感受态细胞的制备及转化操作步骤(一)、感受态细胞的制备()1、从LB固