文档介绍：第十六章 分子发光分析法
一、仪器与结构流程
instrument and general process
二、荧光分析法和应用
fluorescence analysis and application
三、磷光分析法的应用
phosphorescence analysis and application
第二节 分子荧光与磷光分析法
molecular luminescence analysis
molecular fluorescence and phosphorescence analysis
2017/11/11
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成:激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
特殊点:有两个单色器,光源与检测器通常成直角。
基本流程如图:
单色器:选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器;
光源:灯和高压***灯,染料激光器(可见与紫外区)
检测器:光电倍增管。
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仪 器 光 路 图
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仪器框图
该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析;
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同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系,同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种;
同步扫描技术可简化光谱,谱带变窄,减少光谱重叠,提高分辨率; 如图。
合适的可减少光谱重叠;
酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似,发射光谱严重重叠,但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱; >60nm时,只显示色氨酸的特征光谱,实现分别测定。
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可获得三维光谱图的仪器
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
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磷光检测
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。
测量方法:
(1)通常借助于荧光和磷光寿命的差别,采用磷光镜的装置将荧光隔开。
(2)采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。
室温测量时,不需要杜瓦瓶。
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二、荧光分析方法与应用
1. 特点
(1)灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级;为什么?
检测下限:~g/cm-3
相对灵敏度: 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
(2)选择性强
既可依据特征发射光谱,又可根据特征吸收光谱;
(3)试样量少
缺点:应用范围小。
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(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率:
If = Ia
由朗-比耳定律: Ia = I0(1-10- l c )
If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e- l c )
浓度很低时,将括号项近似处理后:
If = I0 l c = Kc
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(2)定量方法
标准曲线法:
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度,绘制标准曲线,再在相同条件下测量未知试样的荧光强度,在标准曲线上求出浓度;
比较法:
在线性范围内,测定标样和试样的荧光强度,比较;
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