文档介绍：寡聚半乳糖醛酸对云南红豆杉细胞悬浮培养中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ生物合成的影响院系:药学院专业:生物制药作者:许栋华指导老师:王剑文副研究员背景简介紫杉醇(taxol) 作为一种作用机制独特的植源性抗癌新药。但由于紫杉醇天然含量很低,加上资源本身亦非常贫乏,因此限制了紫杉醇的进一步开发和应用。为了解决其药源问题,科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径上(如筛选高产量红豆杉栽培品种、化学合成、生物技术及微生物中生产等)进行了艰苦的研究工作。近年来,细胞培养技术已成为对红豆杉属植物研究的重要手段。10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl atinⅢ,10-DAB Ⅲ)是紫杉醇生物合成的重要前体物质,本身亦有抗癌活性。法国研究小组发现10-DAB Ⅲ可从欧洲红豆杉的针叶中提取,%,10-DAB Ⅲ的发现为通过连接紫杉醇侧链半合成紫杉醇提供了较佳方法。迄今已在数种红豆杉属植物中分离到该成分。它不仅来源广泛,而且提取的效率也较高,是一种较易检测及广阔开发前景的紫杉烷类物质。寡聚半乳糖醛酸(OGA)为果胶的不完全酶解产物,其单体半乳糖醛酸是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分,参与细胞壁复杂网架的形成。以OGA为诱导物,可诱导多种植物(如拟南芥、番茄、胡萝卜、马铃薯等)产生抗性反应,促进人参细胞中有效次生代谢产物人参皂苷的合成,本实验测定结果可见,OGA可显著提高云南红豆杉细胞中10-DAB Ⅲ及紫杉醇的含量。?第一部分云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的变化?第二部分寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳浓度的筛选?第三部分寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选第一部分云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内Taxol及10-DAB Ⅲ含量的变化1 材料与方法1). 云南红豆杉细胞的培养研究用的细胞系是经多次继代培养的云南红豆杉(T. yunnanensis)细胞株。在改良的MS固体培养基上继代培养。将生长良好的细胞3 g 转入含30 mL MS液体培养基的150 mL三角瓶中,25℃,110 r/min黑暗振荡培养。2). 红豆杉细胞的处理本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养,分别于接种后第0、1、4、7、10、13、16、19、22 d 收获细胞,提取紫杉醇及10-DAB Ⅲ,HPLC法检测其含量,每种处理3个重复,共8组。3). 紫杉醇及10-DAB Ⅲ的含量分析色谱条件:10-DAB Ⅲ含量测定:色谱柱(Restek C18柱:150 mm× mm,5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(2:3:8),检测波长为232 nm, mL/min,柱温为35℃,进样量为10 μL。Taxol含量测定:色谱柱(Restek C18柱:150 mm× mm,5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(25:35:45),检测波长为227 nm, mL/min,柱温为35℃,进样量为10 ?l。 d干重 g10-DABⅢ含量 mg/g -DABⅢ产量 mg/L干重 g含量 mg/g产量 mg/ d干重 g紫杉醇总产量 mg/ mg/ 10-DAB Ⅲ及紫杉醇生长周期内含量第二部分寡聚半乳糖醛酸(OGA)诱导云南红豆杉悬浮培养细胞浓度的筛选1 材料与方法1).红豆杉细胞的培养()2 ).OGA诱导子的制备多聚半乳糖醛酸经果胶酶室温下裂解20min,过滤,浓缩后冻干成粗OGA粉末。将OGA粉末配成1 g/L溶液,经Sephdex G-10 柱处理滤除MW<700的寡聚物, μm微孔滤膜过滤除菌,作为OGA诱导子备用。3 ).红豆杉细胞的诱导处理本实验将培养的云南红豆杉细胞分成对照组及处理组,处理组设4种不同诱导子浓度,分别为20、40、60、80 μg/mL,对照组加入同量双蒸水。每种处理4瓶,共4个重复。细胞培养至第17天加入OGA,继续培养至第24天收获。4 ).10-DABⅢ及紫杉醇的含量分析() mg/L干重 g10-DAB Ⅲ含量 mg /g mg/ g DW10-DABⅢ干重紫杉醇图4 不同浓度OGA对10-