文档介绍：中山大学
硕士学位论文
抗原致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞体外实验研究
姓名:华佳叶
申请学位级别:硕士
专业:内科学(血液肿瘤)
指导教师:黄仁魏
20040501
抗原致敏树突状细胞诱导杀伤细胞体外实验研究摘要研究目的专业:血液内科硕士生导师:黄仁魏教授硕士研究生:华佳叶体内肿瘤细胞,这些残存的肿瘤细胞次⑿〔辛舨”洌琈歉捶⒌母础临床研究证实异基因造血干细胞移植后的移植物抗白血病вΧ訫的清除,是防止白血病复发的关键,但该效应常伴随移植物抗宿主病,且与后者的严重程度并行,血液中具有вψ饔玫南赴邢赴拘訲淋巴细胞⒘馨鸵蜃踊罨纳鄙讼赴、的细胞、细胞因子活化的杀伤细胞龋钪匾5氖莄。ü赴呀夂陀盏嫉蛲鲎饔锰匾性直接杀伤靶细胞。具有抗原提呈功能、表达共刺激信号的免疫细胞是发挥作用的重要环节,树突状细胞是功能最强的抗原递呈细胞诿庖应答中能显著刺激初始赴鲋常⒊醮魏驮俅蚊庖哂Υ稹2捎酶髦植煌式的肿瘤抗原,体外致敏,可以利用的强大抗原递呈功能,有效地刺激淋巴细胞增殖活化,诱导产生特异性ㄒ恍陨鄙颂囟ㄖ琢鱿赴谥琢雒疫治疗中具有重要意义。捎昧5ズ讼赴浯碳ひ蜃—、自细胞介素一、肿瘤坏死因子三种细胞因子,从健康人外周血单核细胞诱导扩目前血液肿瘤的治疗主要有化疗及造血干细胞移植,但均不能完全清除患者
材料和方法用含%腞嘌号嘌赴搪康资庇靡让赶ù重组人细胞吲子—琁,猘;鼠抗人,,,、无菌抗凝采集健康人外周血,淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞,以/浓度,在罕ズ褪6取条件下孵育∈保竦锰诘南赴加入含痬琁痬腜嘌号嘌、彀量换液,同等量添加上述细胞因子,在第炱鹈刻焯砑覶—用含%小牛血清腞嘌海%。饱和湿度、条件下常规培养。每旎灰海赴搪康资贝ù取健康人孵育∈焙笕》翘谙赴飨赴ǘ痬尤牒/的嘌褐信嘌倒置显微镜下每天观察细胞形态,培养第天的瑞氏染色摄片,并用扫描电镜和透视电镜观察及摄片。芯緿谔逋飧涸豄赴橙诳乖竽芊翊碳び盏疾”牧等流式细胞荧光标记抗体;淋巴细胞分离液。健康志愿者外周血;细胞株;前列腺癌赴辍椒的诱导培养/,第天收获细胞。㏄、。有文睢⒚庖弑硇汀⒒旌狭馨拖赴从Φ确矫娼蠨募ā鄄炜原激活的诱导对靶细胞的特异性杀伤作用。细胞培养.
同种异体混合淋巴细胞反』、组。以同供者的经丝裂霉素同样处理后为对照组。的光密度值。致敏诱导的訩赴匾煨陨鄙俗饔细胞冻融抗原及赴橙诳乖闹票取细胞浓度为痬赴海锤炊橙冢咚倮胄模∩。.舛ㄅ嘌牧馨拖赴蠧、阳性细胞数收集培养的淋巴细胞,涂祝琒ú舛ǎ珹显色,计数龅ジ龊细胞中阳性细胞数。头欧ú庀赴咀饔嘌椒ǎ号嘌旄涸乜乖蟮腄胱蕴辶馨拖赴ǘ缺任/,等液体量混合,加一痬%跫屡嘌天,每三天痬盏汲龅南赴次狢。以同样方法培养未经抗原致敏激活的R訩赴0邢赴訡为效应细胞,按实验要求分实验组:致敏组,第天负载冻融抗原后加自体淋巴细对照组未致敏组何粗旅鬌6哉眨匆钥乖涸兀嘌魇较赴遣釪庖弑沓福簄。嘌牡趌《欤占赴直反应细胞制各:复苏冻存的异体外周血非贴壁细胞,调细胞浓度/。刺激细胞制备:取培养第天的叱悬液,以丝裂霉素去增殖作用后为实验ú饬馨拖赴鲋郴钚裕捍碳は赴敕从ο赴壤直鹞:,,混合培养~小时,加發/妹副暌羌觳獠ǔ滤膜滤过除菌。实验组在培养的第烀亢辽嘌逑导冻融抗原,对照组量换液并添加一四组:胞培养。加入鼠抗人,,,,单抗,流式细胞仪检测。∈保琍..:Ⅱ
结果取三种效靶比:,,0邢赴畲笫头趴祝悦副暌遣獠匝榭護琒邢赴匀皇头趴譕琈邢赴畲笫头趴合培养后,见诱导出具典型形态的细胞:体积增大,表面有毛刺样突起,随培养时间的增长,有突起的细胞增多,毛刺增密、变长,第天左右凋亡。未加细胞因子的单个核细胞表面无突起,在第焖劳鱿赴龆唷瑞氏染色可见体积明显较淋巴细胞大,表面有伪足样突起,胞浆量多。扫描电镜下可见细胞表面粗糙,有粗大幔状突起及细长飘带状、树枝状透射电镜下可见向外伸展出粗细不等的树枝样突起,胞浆中线粒体发达。收集经、一蚑—联合培养天的细胞,应用流式细胞仪分析,表达的细胞达以上,表达的细胞为.%,.%,而的标志小于ァ同种异体混合淋巴细胞反应在簂琹:,刺激细胞与反应细胞比例时,实验组胍焯对照组淋巴细胞对照组旱ゴ棵盘辶馨拖赴┮訢せ睢对照组哉兆:第旄涸匦擦邢侔┫赴橙诳乖腄幼蕴辶巴细胞一起培养。法测定激发的械腃、阳性细胞数,具体操作同以乳酸脱氢酶头欧ú舛ㄏ赴拘вΑ7直鹑∩鲜龈髯樾вο赴长为膐担韵铝泄郊扑阈вο赴纳鄙嘶钚浴细胞杀伤活性计算:细胞毒/统计分析数据用繱表示,.。的形态学观察倒置显微镜观察培养细胞:贴壁的单个核细胞经、和细长突起。魇较赴枪鄄霥硇加自体淋巴细胞后一起培养。
效靶比为:时,实验组诱导的訩赴纳鄙寺史