文档介绍：AN142用氨基酸直接分析法测定色氨酸AN142用氨基酸直接分析法测定色氨酸前言由于在蛋白质和多肽水解制样过程中色氨酸会发生化学分解,所以蛋白质和多肽中色氨酸的测定是比较困难的。因此人们发展了许多方法来单独保存和测定这种氨基酸。为了保存色氨酸,可将一些硫醇抗氧化剂如巯基乙酸、亚硫基二乙酸或十二烷基硫醇12等被加入到6N盐酸溶液中。加入苯酚的做法也有报道3-5。另外采用对***苯磺酸6,含3-2-氨基乙基吲哚的***磺酸7和巯基***磺酸89取代盐酸进行样品水解可以改善色氨酸的回收率。人们也对碱水解进行了研究,并已经证明碱水解对色氨酸的回收率要优于酸水解10。在进行碱性水解时加入一些还原性试剂如锡矿11、或抗氧化剂如淀粉12、或其他保护剂如乙酸铅和组***酸铅的混合物13等可以改善色氨酸的回收率。水解时用聚丙烯试管代替硼硅玻璃试管也能够提高色氨酸的回收率14。在进行碱性水解时采用氢氧化钠代替氢氧化钡可以防止色氨酸的沉淀和吸附。另外在真空或者惰性气体保护下进行水解也可改善色氨酸的回收率。在早期的旨在提高灵敏氨基酸测定回收率的水解技术的研究开发中,人们认识到色谱分离技术是一个可提高测定特异性和消除干扰的方法。SpackmanMoore和Stein等的开创性的研究工作建立了最为广泛的为人们接受的氨基酸分析方法,那就是阳离子交换色谱法1215-22。这种柱后衍生方法使用Moore等发展的二甲亚砜-茚三***试剂来提高测定的灵敏度。后来人们也研究了使用淀粉柱14、凝胶过滤24和气相色谱25等分离技术。上世纪七十年代反相高效液相色谱RP-HPLC的发展引出了氨基酸的柱前衍生快速测定方法26-28。现在常用的测定色氨酸的方法是AOAC推荐出版的方法29。该方法使用氢氧化钠水解,水解后调节pH,再经过离心处理,则所得到的清液就可以用氨基酸分析仪进行测定了。氨基酸分析仪并不仅仅使用于这种分析程序中,它还被经常使用在氨基酸的阳离子交换色谱和茚三***柱后衍生方法以及氨基酸的反相液相色谱及其紫外或荧光衍生测定方法中。阳离子交换色谱测定氨基酸常常需要1h时间,而反相色谱则仅仅需要45min30。为了得到高到中级皮摩尔的色氨酸测定灵敏度,这两种方法或需要柱后衍生,或需要柱前衍生。衍生使得方法复杂化,并需要付出额外的劳动、花费,也给分析方法带来了一定的不确定性。在本应用方法中,我们将氨基酸直接分析方法应用于蛋白质、多肽、细胞培养液和发酵液中色氨酸的测定。该方法既能用阴离子交换色谱法AminoPacTMPA10直接分离常见氨基酸,又能用积分脉冲安培检测方法IPAD直接检测这些氨基酸3132。在本方法中,我们给出了专门为从自由氨基酸、糖和多肽片段中快速将色氨酸淋洗分离出来的等度色谱程序。使用该方法色氨酸可被以非常高的灵敏度检测(低皮摩尔水平进样)。该方法将色谱运行时间减少至12min,与传统方法相比,大大提高了分析效率。设备DionexBioLC色谱系统,由以下部件组成:GP50或GS50梯度泵,微孔,PEEK材料流路,带有脱气装置;带有氨基酸金电极的ED50电化学检测器;AS50自动进样器;配有25L进样环的可控温柱温箱;包括三个2-L塑料淋洗液瓶和压力表的EO1淋洗液组织器。色谱工作站。Peacti-ThermIII-Reacti-BlockH加热模块;真空水解管8×60mm1mL。带盖的微型离心