文档介绍：分离纯化过程中蛋白质的分离纯化过程中蛋白质的稳定性稳定性孙万儒中国科学院微生物研究所蛋白质的结构蛋白质的结构蛋白质的稳定性?蛋白质的稳定性主要是指保持其生物活性的能力。与蛋白质结构,构象有关。?关系到分离纯化的活性收率,生产成本。?关系到蛋白质制剂能否应用和商品化。?在分离纯化过程中关注的是:那些因素影响蛋白质稳定性。如何减少活性损失,保持稳定失活机理失活机理?失活包括两个步骤:N D I天然态N:肽连正确折叠,紧密,球或棒状分子,自由能最低(40-120kj/mol)。过度态D:构象变化,包括若干中间态,可逆,部分或大部失活。失活态I :完全变性,无序结构,不可逆,自由能最高(>400kl/mol)。包括共价键变化、SH氧化、SS键还原、磷酸化、脱氨。失活机理失活机理?天然态在一定程度上仅是热力学稳定,低自由能使其倾向于不稳定,环境的微小变化也会引起负自由能变化。自由能仅决定平衡时的天然态和可逆变性态的比例,不能说明达到平衡的速度。?达到平衡时的速度是由变性和复性的自由活化能决定。变性活化能不同于天然态和活化态的自由能;复性活化能不同于活化态和变性态的自由能。失活机理失活机理失活机理变性条件1. 凝聚(有时伴随S-S键形成)热,盐酸胍,脲,SDS,震荡2. 一级结构改变?H+和OH-催化肽键水解,酶水解,极端pH,热,蛋白酶自水解?功能基团氧化(SH,吲哚环)氧化(特别是加热)和它的代谢物?S-S键还原,分子内SH与S-S交换热,高pH,硫醇,二硫化物?分子内S-S键再交换高pH,加热失活机理失活机理失活机理变性条件?重要SH修饰金属离子,二硫化物?蛋白质磷酸化蛋白质激酶?催化活性中间物引起的‘***失活’底物?氨基酸消旋加热,高pH?次级序列形成的S-S键断裂加热,高pH?Asn脱氨加热,高pH失活机理失活机理失活机理变性条件3. 辅酶从活性中心上解离螯合剂,硫醇,透析,金属离子,加热4. 寡聚蛋白解离成亚基化学修饰,极端pH,脲,表面活性剂,高或低温5. 蛋白质吸附容器表面小蛋白浓缩,加热6.‘不可逆’构型变化加热,极端pH,有机溶剂,盐酸胍7. 液流的剪切失活流体力学物理因子物理因子?热:在Tm以上,变性自由能成负值,有助于变性。热使蛋白质的肽链松散,低温下这种变化是可逆的,超过Tm,结构变化不可逆。?冷:大多数蛋白质在0-4℃最稳定,但在低温冷冻和融化时会发生失活。冷冻失水,使结构发生变化。?pH:pH变化引起蛋白质分子的电荷和共价键变化,使肽链松散,引起变性和失活。在酸性条件下,有的蛋白质稳定,有的极为敏感。组氨酸和天冬酰氨易脱氨。在碱性条件下,有的稳定,有的不稳定。SH和S-S活泼,易发生β-消除作用。?机械力:高压,超声,剪切力,表面张力。化学因素化学因素?氢键干扰:脲,盐酸胍,甲醛干扰天然态蛋白质分子内外维系结构和构象的氢键的形成。乙酰氨,烷脲具有强的形成氢键能力,使肽链疏水化,破坏天然态结构和构象。是强变性剂。?氧化剂:氨基酸侧链氧化,特别是功能基团氧化。敏感氨基酸有SH、S-S、吲哚环等。?中性盐:低浓度下,蛋白质必需的金属离子盐有稳定作用,重金属离子,Hg,Cd和Pb与蛋白质结合或与蛋白所需金属离子竞争抑制生物活性或造成失活;高浓度下,可使蛋白质沉淀。与离子有关,与电荷类型无关。硫酸铵、磷酸钾用于沉淀和稳定天然态;KCl和NaCl作用小。