文档介绍：重组DNA技术
binant DNA Technology
刘新文
北京大学医学部生物化学与分子生物学系
第一节概述
DNA克隆(DNA cloning):应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。
基因工程(ic engineering):实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术(binant DNA technology)
一、克隆体系:目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等
1、目的基因(target gene):cDNA或基因组DNA
2、载体(vector):质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等
cDNA (complementary DNA):指体外经反转录合成的,与RNA (常指mRNA)互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。
基因组DNA(genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,称为基因组DNA。
质粒(plasmid):存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内,能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。
3、工具酶:限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶,等
常用的是II类限制性内切酶
许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构
patible end):不同限制性内切酶产生的相同粘性末端
DNA聚合酶:大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、Klenow片段(Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等
DNA连接酶
T4 连接酶:可用于粘端与平端的连接
4、宿主细胞:大肠杆菌、酵母、动物细胞
第二节 DNA克隆的基本过程
分、切、接、转、筛、表达
一、“分”:目的基因及载体的制备
1、分离基因的方法:化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR):在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶(常用Taq酶),经多次变性、退火、延伸循环反应,使目的DNA呈指数合成的过程
cDNA文库(cDNA library):以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。
基因组DNA文库(genomic DNA library):利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有基因组DNA信息,总称基因组DNA文库
2、常用载体:质粒、噬菌体、病毒DNA
克隆载体(cloning vector):用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等
表达载体(expression vector):用于在宿主细胞中表达外源目的基因,获得大量表达产物
二、“切”:限制性内切酶切割目的基因和载体DNA
三、“接”:重组体的构建
四、“转”:重组DNA分子导入受体细胞
1、转化(transformation):将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌),并使其获得新的表型的过程
2、转染(transfection):将外源DNA导入真核细胞的过程
3、感染(transfection):以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的细胞,并在细胞内扩增。也称为转导(transduction)
五、“筛”:筛选出含重组DNA的受体细胞
1、直接选择法:遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂交)】
2、非直接选择法:免疫化学法、酶联免疫检测法
六、“表达”:使克隆基因在宿主细胞中复制、表达
1、外源基因在原核细胞的表达
大肠杆菌是最常用的原核表达体系
真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体
2、真核表达体系:酵母、昆虫及哺乳动物细胞等