文档介绍：HPV病毒的常用通用引物检测摘要研究表明,HPV病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关。对感染个体的病毒检测具有重要的疾病诊断、治疗、预防意义。但目前缺乏可以兼顾敏感性、特异性、操作简单,可以大规模推广使用的可靠检测方法。对待测样本进行PCR检测仍是目前实验室最多采用的检测方法。PCR具有高敏感、易操作的优点,但其反应的灵活性和极高的敏感性,也带来了假阳性和假阴性的问题。针对HPV病毒L1序列保守区域设计的通用引物检测,最常被应用于大样本检测。通用引物可以在一次PCR反应中同时检测多种型别的HPV病毒感染,与序列特异PCR检测相比,可以大大减少检测的工作量。但其缺点在于,通用引物仅与某个或少数HPV型序列匹配,而对于多数型别HPV,引物结合区都存在或多或少的碱基错配。这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同。因此,使用通用引物检测HPV感染时,对于某些与引物匹配较差的HPV型别,其感染情况往往可能被低估。目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三类:1)单一引物如:GP5+/6+。2)简并引物如:、MY09/11。3)混合引物如:SPF1/2。个型通用引物都有其各自的优缺点,需要根据特定试验的目的、条件选用合适的通用引物进行检测。【关键词】HPV病毒;通用引物;单一引物;简并引物;混合引物HPV病毒是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒,其基因组长约7900bp。目前约共发现约200多型HPV病毒。该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞,造成上皮增生甚至恶性转化[1][2][3]。人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV,其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关,如:16、18、31、33、35等,这部分HPV病毒被称为高危型[4][5]。而HPV6、11等型别主要存在于良性病变中,多造成生殖道疣等疾病,被称为低危型[6][7]。但人为区分的高危型和低危型并不是绝对的,因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型HPV[8]。多数HPV病毒对人体的感染都是一过性的,病毒很快会被人体免疫系统清除。但少数情况下,病毒整合入宿主基因组DNA,转变为持续感染[9]。这种感染方式被认为与感染部位的恶性病变相关[10]。接近100%的宫颈癌样本中都可以检测到HPV病毒的存在[11][12]。据估计,每年约290,000人死于宫颈癌。同时每年有490,000例新发宫颈癌病例[13]。因此,对HPV病毒有效的检测方法,将具有重要的临床和社会意义。目前,HPV病毒尚不能人工体外培养,而HPV的血清学检测技术也不成熟。因此,对HPV感染的检测方法仍然局限于使用分子生物学的方法在待测样本中直接检测,如:原位杂交、液相杂交(杂交捕获技术)等[14][15][16][17][18]。但是这些方法不但操作复杂,而且敏感性有限。HPV病毒的PCR检测虽然具备操作简单、高敏感性的优点,但污染严重、容易产生假阳性,因此无法推广到临床应用。目前尚缺乏一种能克服上述所有缺点,同时保持各自优点的成熟检测方式。对于具有严格的污染控制,同时需要高敏感、大样本的检测HPV病毒的实验室,使用PCR检测仍是首选方案。但是鉴于HPV存在如此多的类型,对每一型都使用其特异引物进行PCR检测将是十分巨大量的工作。同时,序列特异PCR只能扩增序列已知的HPV。对于未知HPV型或存在变异的HPV则不能有效扩增检测。因此,人们选取HPV基因组序列中较为保守的L1和E1基因区域设计通用引物,以实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV的目的[19][20][21]。本文对目前常用的HPV通用引物进行了综述,在各自引物的序列分析基础上,对其优缺点进行了阐述。一、HPV病毒的PCR通用引物检测通常,通用引物的设计遵循三条原则:1)上下有引物均为惟一序列,通用引物只与某一型或少数几型HPV扩增序列完全匹配。在多数HPV型的引物结合区域,通用引物均存在或多或少的碱基错配。使用该种类型的通用引物,应当使用较低的煺火温度,以保证引物可以与存在碱基错配的HPV型结合。这种通用引物的代表为GP5+/6+[22][23]。2)通用引物由一系列简并引物混合而成,这些引物的某些特定位点随机出现两到三种不同的碱基,通过这种方法来弥补不同型别HPV在这些位点的序列差异。简并引物的代表为MY09/11[24]。3)通用引物的上下游均由一系列不同的引物混合构成,这些引物充分考虑了各型HPV在特定位点的序列差异,在混合引物中,尽量存在与各型HPV均达到碱基完全配对的引物。对于某些多数HPV都在此处存在较大的序列差异的位点,这种通用引物在此位点引入肌苷来替代常规的碱基。这一位点的肌苷虽然不能与模板序列形成共价配对,但也不致形成空泡。这种通用引物与各型HPV碱基配对都较好,因此可以采用较严格的PCR条件。其检测效率和敏感性也较高。代表引物为S