文档介绍：流感病毒的快速检测方法一、 RT-PCR快速诊断方法(一) 生物安全要求(二) 病毒核酸提取(三) RT-PCR(四) PCR产物纯化(五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、 免疫荧光方法检测流感病毒(一) 原理(二) 标本处理(三) 间接免疫荧光法(四) 结果判断三、 实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)快速诊断检测(一) 基本原理(二) 实验试剂(三) 实验步骤四、 快速诊断试剂盒流感的快速检测方法,与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-TimePCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-TimePCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法,即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR)。流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNA。逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶,因此,扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。RT-PCR需要一对型别特异引物,四种脱氧核苷酸(dNTPs),RNA模板,逆转录酶及TaqDNA多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25~30个循环,使DNA产物达到倍增的效果。生物安全要求生物安全级别与个人防护要求:生物安全二级实验室,防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行,核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。病毒核酸提取实验材料及仪器QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)70%、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头可调14K微型离心机旋转混合器操作步骤取1支无菌、,加入500μlRLT。取采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)100μl,加入上述Eppendorf管中。加5μlβ-巯基乙醇,充分混匀。加600μl70%乙醇,于旋转混合器混匀。从试剂盒中取出带滤膜的离心柱,并标上标本号。将第4步的混合液体分两次(每次600μl)吸入于滤柱中,12000rpm离心15秒,弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上,将第4步的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm离心15秒,弃收集管中液体。于滤柱中加入700μlRW1,12000rpm离心15秒。从试剂盒中取出一支新的2ml收集管,将离心后的滤柱转到新的收集管上,于柱子中加入500μlRPE,12000rpm离心15秒弃收集管中液体。滤柱放回收集管上,于滤柱中加入500μlRPE,13000~14000rpm离心2分钟。,,于滤柱中加入30~50μl无RNA酶的水,室温静置