文档介绍：复旦大学
博士学位论文
甲醇中毒视网膜功能结构和蛋白质组学研究
姓名:陈捷敏
申请学位级别:博士
专业:法医学
指导教师:赵子琴
2012-04-11
甲醇中毒视网膜功能结构和蛋白质组学研究中文摘要甲醇是重要的化工原料和有机溶剂,是工业用酒精的主要成分之一,由于其价格低廉、来源广泛,且具有微弱的乙醇香味,时常被一些不法分子用于制造假酒,引起群体性中毒事件并造成恶劣的社会影响;在生活和生产中,通过皮肤接触或是呼吸道吸入致甲醇急慢性中毒的案例也时有发生。急性中毒多因误服甲醇代替乙醇作为饮料所致,由于多数患者不会意识到饮用假酒这一事实,临床诊断和治疗往往不够及时和准确,甚至于漏诊,以至于造成极其严重的后果。中毒者以视力障碍和神经系统症状较为突出,严重者甚至于死亡,并且即使经过抢救等及时治疗,视力障碍也通常难以完全恢复。因甲醇中毒死亡或致残的,多会酿成严重的刑事案件或民事纠纷。中毒后幸存者往往需要鉴定损伤程度和伤残等级的评定,有时也会涉及中毒与不良后果之间因果关系的鉴定,其中又常涉及视觉功能检验,这就需要我们对甲醇中毒对视网膜的毒性作用和损害机制有全面、深入的了解。作为甲醇毒性的一个重要靶器官,视网膜的宏观功能、微观结构、分子组成等方面在甲醇的毒性作用下都会发生一定改变。视网膜电图作为视网膜功能的客观检测方法之一,在临床上被广泛作为视网膜疾病与视网膜损伤的诊断和治疗依据。由于视网膜电图各波形可以反应视网膜不同细胞的生物电活动,所以视网膜电图不仅可用于评估甲醇对视网膜造成的宏观功能损害,而且可以在细胞层面反映视网膜不同细胞的受损情况。近年来蛋白质组学逐渐在毒理学研究方面崭露头角,作为高通量的蛋白质研究方法,其不仅可用于筛选生物学标志物,也可为毒理学作用机制的研究提供新的方法。本课题在原有研究基础和研究方法上,将研究甲醇对视网膜功能、形态以及蛋白质分子的毒性作用,并探讨甲醇对视网膜的毒性作用机制。主要的研究内容为以下霾糠郑第一部分甲醇中毒视网膜功能改变研究为研究不同甲醇剂量和不同毒性作用时间下的视网膜功能,建立了甲醇中毒的实验大鼠模型笫,并依据给毒剂量和毒性作用时间分为中毒剂量组,中毒剂量熳楹偷图亮天组、低剂量熳椤R谰軮娑ǚ椒ǎ直鹪诎凳和明视状态下进行大鼠视网膜电图的检测,结合统计学方法研究甲醇对视网膜视杆细胞反应、最大混合反应和视锥细胞反应的影响。研究发现:甲醇毒性致视网复旦大学博士学位论文
膜功能呈现不同程度下降,中毒剂量甲醇对明视、暗视系统损害都较大,暗视系统损害较重呈现进行性下降,而明视系统损害进展缓慢。较低剂量的甲醇会造成以暗视系统为主的一过性损害。第二部分视网膜与肝肾等代谢相关组织病理形态学改变研究为了研究视网膜在甲醇毒性作用下的组织学改变,以及组织结构随时间改变的特征,我们特取视网膜组织进行光学显微镜和透射电子显微镜观察其显微结构和超微结构变化。同时取部分肝肾组织进行组织学比较研究,以研究视网膜对甲醇毒性的敏感性。组织经过固定、脱水、包埋、切片、染色等流程,在光学显微镜下视网膜呈现细胞水肿和组织疏松,以外层视网膜为甚。透射电子显微镜下,发现线粒体水肿、空泡、嵴断裂等表现。但不同剂量和不同毒性作用时间下的视网膜结构改变特点有所不同:中毒剂量的甲醇会造成光感受器和内核层细胞组织形态的改变,并且随中毒时间延长组织学改变有加重趋势;光感受器的线粒体损害早于内核层线粒体损害的发生;低剂量甲醇对视网膜组织结构的毒性作用是可逆的;视网膜较其他器官对甲醇更为敏感。第三部分甲醇血浓度的检测与分析为研究甲醇的代谢情况,利用顶空气相色谱法检测各组实验动物血中的甲醇浓度。顶空气相色谱法是一种可稳定准确检测血甲醇的定性定量方法。将各组实验动物引颈处死后,取心血及时保存于抗凝管中,将难Q叔丁醇混合,直接进入顶空进样器,每个样本经检测器虵检查两次。研究发现甲醇的保留时间为恢卸炯亮康募状荚诟天后仍可被检测到,说明甲醇在体内代谢缓慢,存在一定蓄积性。第四部分甲醇中毒视网膜蛋白质组学研究为研究甲醇中毒后视网膜蛋白质组学的变化,提取临床中毒症状和视网膜功能障碍最严重的中毒剂量熳楹投哉6哉兆榈氖油さ鞍字什⒍浚双向凝胶电泳分离、凝胶染色和图像采集分析,认定灰度相差兑陨衔5牡白质为差异蛋白,并胶上酶解差异蛋白,经过猅—质谱鉴定,成功筛选出个差异蛋白质,其中上调的蛋白包括个,如,,,.下调的蛋白包括觯鏷瑃琺琺琺复旦大学博士学位论文琣....,琯
琺,...晶状体蛋白瓀验证确系明显上调。差异蛋白种类和功能涉及到细胞骨架相关蛋白、与代谢及线粒体功能相关蛋白、视网膜特有结构和功能蛋白。从毒性反应分析,甲醇对视网膜蛋白质造成的影响一方面在于甲醇及其代谢物对视网膜组织蛋白的直接毒性作用,包括对细胞骨架相关蛋白和对线粒体功能相关蛋白的损害;另一方面的