文档介绍：东北农业大学
硕士学位论文
Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒
2型的构建
姓名:葛艳华
申请学位级别:硕士
专业:基础兽医学
指导教师:曲连东
20090609
摘要
摘要
犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起
的犬及其他肉食动物的一种急性或亚急性、高度接触性传染性疾病,是我国当前对养犬业、
毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。常规弱毒疫苗虽然在 CD 防控中发
挥了非常重要的作用,但是也存在诸多缺点。加之犬瘟热病毒对流行因素的逐渐适应以及大
量变异株的出现,全球范围内,犬瘟热的感染呈上升趋势,且其中有很多是免疫群体爆发犬
瘟热的报道。因此,有必要寻求更加安全、有效的影响新型疫苗。
本研究首先对 Asia-1 型犬瘟热病毒分离株(HLJ2-07 株) 优势保护性抗原基因-H 蛋白
基因进行了序列测定、遗传进化分析、真核表达和重组质粒 DNA 的小鼠免疫试验,初步验
证其免疫原性。并在此基础上把 H 基因定向克隆入本实验室已构建完成的通用转移载体 pUC-
△E3-EGFP 中,构建了含有犬瘟热病毒 H 基因的转移载体 pUC-2△E3-H。对实验室已构建的
表达绿色荧光蛋白的重组犬腺病毒 2 型 rCAV-△E3-EGFP 进行了蚀斑筛选、纯化和 PCR 鉴定,
对纯化完全的病毒进一步进行了生物学特性分析(形态学鉴定、重组病毒与亲本毒株的病毒
滴度比较、生长特性分析、遗传稳定性分析)。最后以转移载体 pUC-2△E3-H 转染 rCAV-△
E3-EGFP 感染的 COS-7 细胞,经体内同源重组,获得了表达犬瘟热病毒 H蛋白的重组犬腺
病毒 2 型 rCAV-2△E3-H。
序列测定结果显示:H 基因全长 1824 bp,编码 607 个氨基酸,含有 9 个潜在的 N-联糖
基化位点和 12 个半胱氨酸残基。同源性分析表明:CDV HLJ2-07 株与 Onderstepoort、Convac
疫苗株亲缘关系最远,核苷酸同源性仅为 %和 %;系统进化分析显示:HLJ2-07 株属
Asia-1 型;与 32 株中国分离株比对,显示目前国内大部分分离株属于 Asia-1 型。由此,一
方面说明,基因型的改变可能是 H 蛋白抗原性变化的一个重要原因。另一方面,显示出从国
内主要流行株中选取合适毒株,构建疫苗的必要性和必需性。H 蛋白的真核表达及免疫原性
分析结果显示:-H 免疫组血清可与感染已知 HLJ2-07 株病毒的 MDCK-SLAM 细胞
发生特异性 IPMA 反应,染色后使细胞呈现阳性的棕红色,证明免疫动物后可产生抗 CDV
抗体;ELISA 血清抗体滴度可达 1:28~1:79;病毒中和抗体可达 1:11~1:32,表明 H 蛋
白具有免疫原性。重组病毒 rCAV-△E3-EGFP 的感染 MDCK 细胞后,待出现 90%以上细胞
病变时收获病毒,经数次蚀斑筛选和纯化,PCR 鉴定,最终达到纯化完全,生物学特性研究
显示,EGFP 基因的插入和 E3 区的缺失不影响重组病毒的增殖特性,其毒力、生长特性与亲
代病毒 CAV-2 相似,保持原有疫苗株的生长特性,且在 MDCK 细胞上连续传代 25 代遗传性
状稳定,显示出一定得应用前景。基于重组病毒 rCAV-△E3-EGFP,我们经构建好的转移载
体 pUC-2△E3-H 经纯化后用脂质体法转染感染了 rCAV-△E3-EGFP 的 COS-7 细胞,病变明
显时收毒,经蚀斑纯化和 PCR 鉴定,获得重组病毒 rCAV-△E3-H。通过 PCR、IFA 鉴定,重
组病毒能表达 CDV H 蛋白。
本研究在对本室分离的犬瘟热病毒 HLJ2-07 株 H基因进行了克隆及序列分析的基础上,
进行了真核表达和免疫原性评估,纯化了表达 EGFP 基因的重组病毒 rCAV-△E3-EGFP,并
在此基础上成功构建了表达 H 蛋白的重组犬腺病毒 2 型载体,为下一步的重组腺病毒在遗传
稳定性、生长动力学及试验免疫研究奠定基础。
I
东北农业大学农学硕士学位论文

关键词:犬瘟热;犬腺病毒 2 型;重组病毒;H 基因;真核表达;
II
Abstract
Immunogenicity Analysis of H Protein of Asia-1
Serotype Canine Distemper Virus and Construction of
binant Can