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· · 医药论坛杂志年月第卷第期
对细胞表达及
端粒酶活性的影响
何淑霞,刘东红
漯河市中医院检验科漯河市
摘要目的研究技术对肝癌细胞系表达及端粒酶的抑制作用,探讨
抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法体外转录合成并转染入细胞株中,应用—观
察细胞中表达改变,检测蛋白的表达,应用末端重复片断扩增一酶联
免疫吸附—方法测定转染、后细胞端粒酶活性。结果转染后,对
细胞和蛋白表达明显抑制。转染后端粒酶活性转染组均数为.±.,与未转染组均
数.±.、空质粒阴性对照组均数.±.比较,差异有统计学意义.;端粒酶活
性转染组均数为.±.,与未转染组均数..、空质粒阴性对照组均数.±.比
较,差异有统计学意义.。结论靶向的,能有效抑制肝癌细胞系——
和蛋白表达及端粒酶活性。
关键词干扰;细胞系;小干扰;人端粒酶逆转录酶;端粒酶
中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:—
人端粒酶逆转录酶以×/孔接种孔板,待细胞融合达%时,
,是端粒酶最重要的部分,端粒应用脂质体转染。分为转染组、空
酶活化和细胞癌变的限速步骤,抑制其表达可有载体阴性对照组和未转染组,具体步骤按说明书
效地抑制肿瘤细胞的生长并诱导凋亡,目前已成操作。
为肿瘤基因治疗的理想靶标。我们拟选择端粒酶. —检测的表达以
活性限速因子基因作为研究靶点,体外转试剂提取细胞总,抽提后用紫外分光光
录法合成,转染肝癌细胞系,检测其度计测定浓度和纯度,按逆转录试剂盒说明
对肿瘤细胞中表达和端粒酶活性的通过—反转录为,以—作为
抑制,研究结果将确定特异抑制端粒酶活性的内对照。引物序列为::上游一.
的靶点,为进一步开发抗肿瘤新药和基因治一,下游一.
疗提供实验和理论依据。一,扩增片段长度邝一
引物序列:上游一.
材料与方法
一,下游一—
. 材料细胞株由本室保存。一,扩增片段长度。反应条件
购自上海吉凯基因公司、胎牛血清购自—为:预变性,℃,,℃
公司,高糖购自公司,端,个循环,最后延伸。取
粒酶试剂盒购自公司,质粒纯化试剂盒购自产物经.%琼脂糖凝胶电泳鉴定,凝胶成像
公司,』购自’分析。
公司,试剂盒购自上海康成生物工程. —检测转染前后的表
公司。达后,收集未转染组、转染组、
. 细胞培养细胞使用培养液培非特异转染组细胞,—检测方法同
养,内含% 胎牛血清、青霉素/、链霉素.。
/,置℃、%培养箱培养。. 检测蛋白的表达转染后
. 细胞转染转染前,将对数生长期细胞收集细胞,提取总蛋白,蛋白行—
电泳,将蛋白质转移至硝酸纤维素膜,%脱脂奶
漯河市中心医院检验科漯河市室温封闭,一抗℃孵育过夜,用含.%
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的缓冲液漂洗次,每次数..比较,差异有统计学意义
;加入相应的碱磷酶标记的二抗:,室.。端粒酶活性转染组均数为.±
温,用显色底物//::显.,与未转染组均数.±.、空质粒
色,以等量蛋白质上样对照,每个样本至阴性对照组均数.±.比较,差异有统
少重复次。计学意义.。与未转染组和空质粒阴性
.端粒酶活性的检测取×细胞到—对照组相比较,转染组细胞中的胞端粒酶活性显
管,离心后弃上清,再加入裂解液,冰上著下降。转染组的抑制率:转染组抑制率为