文档介绍：PCRPCR扩增扩增检测转基因大豆、玉米检测转基因大豆、玉米【【实验目的实验目的】】??通过通过PCRPCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分产品是否含有转基因成分??培养学生的实验设计能力和创新能力培养学生的实验设计能力和创新能力以大豆特异性内源基因大豆凝集素以大豆特异性内源基因大豆凝集素((LectinLectin))基因或者玉米特异性内源基因基因或者玉米特异性内源基因IVRIVR为内参,为内参,花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒35S35S启动子启动子(CaMV35S(CaMV35S启动启动子子))、农杆菌胭脂碱合成酶终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS(NOS终止终止子子))及外源基因及外源基因55--烯醇***烯醇***--莽草酸莽草酸--33--磷酸合酶磷酸合酶(CP4(CP4--EPSPS)EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。的转基因成分。【【实验原理实验原理】】【【实验步骤实验步骤】】大豆、玉米大豆、玉米DNA DNA 提取提取----改良的改良的CTABCTAB法法??,在研钵中充分研磨。加入样品,在研钵中充分研磨。加入10001000μμL CTABL CTAB提取提取液,继续研磨充分后加入到液, EpEp管中;向管中;向EPEP管加入管加入44μμL L RNaseARNaseA,至于,至于6565℃℃水浴,过程中混匀水浴,过程中混匀3~53~5次,次,30min30min,,12000r/min12000r/min室温离心室温离心10min10min;取上清于新的;取上清于新的EpEp管中,加入等体积管中,加入等体积***仿:异戊醇***仿:异戊醇(24: 1)(24: 1),轻缓颠倒数次,轻缓颠倒数次((或至于漩涡震荡器上混或至于漩涡震荡器上混匀匀)),室温静置,室温静置5min5min,室温,室温12000r/min12000r/min离心离心10min10min;重复加入***仿;重复加入***仿异戊醇一到两次异戊醇一到两次((过程中如上清液量太少,可适量加入三重蒸馏过程中如上清液量太少,可适量加入三重蒸馏水水));取上清于新的;取上清于新的EpEp管管((千万不要吸入下层液体千万不要吸入下层液体)),再加入等体,再加入等体积的积的CTABCTAB沉淀液,轻缓颠倒混匀后室温静置沉淀液,轻缓颠倒混匀后室温静置1h1h,,15000 r/min15000 r/min室室温离心温离心10min10min;弃上清液,加入;弃上清液,加入400400μμL ***化钠溶解沉***化钠溶解沉淀,淀,5656℃℃温浴温浴15min15min,期间轻摇,期间轻摇EPEP管数次助溶;加入管数次助溶;加入800800μμL L --2020℃℃无水乙醇,无水乙醇,--2020℃℃静置静置1h1h,,15000 r/min15000 r/min室温离心室温离心10min10min;弃上;弃上清液,用清液,用75%75%乙醇洗涤沉淀两三次后,在室温下自然风干用三重乙醇洗涤沉淀两三次后,在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于蒸馏水溶解储存于44℃℃。。【【实验步骤实验步骤】】基因组基因组DNADNA浓度和纯度的鉴定浓度和纯度的鉴定??取取55μμLL样品溶于样品溶于9595μμLL三重蒸馏水中,用三重蒸馏水中,用BiophotometerBiophotometer分析分析DNADNA的浓度,通过它对提取大豆的浓度,通过它对提取大豆DNADNA测测ODOD值。并值。并记录数据。由记录数据。由OD260nm/OD280nmOD260nm/OD280nm判定基因组判定基因组DNADNA的浓的浓度,其比值在度,~~,符合之间较好,符合PCRPCR检测要求。检测要求。??聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是是一种选择性体外扩增一种选择性体外扩增DNADNA的方法,其基本原理类的方法,其基本原理类似于似于DNADNA的天然复制过程。的天然复制过程。它包括它包括: : 变性变性(Denature) (Denature) 、、退火退火(Anneal)(Anneal)和延伸和延伸(Extension)(Extension)三个基三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环,理论上本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的每一轮循环将使目的DNADNA扩增一倍,这些经合成扩增一倍,这些经合成产生的产生的