〖医学〗PCR扩增基因.ppt

文档介绍：实验---- PCR扩增基因
【实验目的】
通过本实验学****PCR反应的基本原理与实验技术。
【实验原理】
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类似于DNA的天然复制过程。它包括: 变性(Denature) 、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。
Step1. 变性:加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
Step2. 退火:溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。
Step3. 延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链为模板,利用引物的3’-OH,以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物,按5’-3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
PCR反应混合物的组成:
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板
反应缓冲液
dNTP
MgCl2
两个DNA引物
耐热Taq聚合酶
【仪器耗材与试剂】
(一)仪器与耗材
1. PCR热循环仪
2. 琼脂糖凝胶电泳系统
3. 吸头、离心管
(二)试剂
1. 10×PCR Buffer
2. MgCl2 25 mmol/L
3. dNTP ( 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP;每种浓度均为10 mmol/L )
4. T3引物与T7引物(40 μM)
5. Taq DNA聚合酶(5 U/μL)
6. DNA模板(pUC19质粒DNA,100ng/μL )
7. 电泳缓冲液 50×TAE (242g Tris碱、 mL 冰乙酸和100 mL EDTA (pH )混合溶解后加水定容至1 L)。
【实验步骤】
1. mL Eppendorff管内配置50 μL反应体系:
反应物
体积(μL)
dd H2O

PCR缓冲液(10×)
5
MgCl2 (25 mmol/L)
4
dNTP (10 mmol/L )

引物1

引物2

Taq DNA聚合酶
1
模板DNA
1
2. 按下述程序进行PCR扩增:
1) 94℃预变性 3 min;
2) 94℃变性 1 min;
3) 55℃退火 45 sec;
4) 72℃延伸 1 min;
5) 重复步骤2~4, 34次;
6) 72℃延伸 10 min;
7) End.
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制1%琼脂糖凝胶,取10 μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后,在紫外灯下观察结果。