文档介绍：分类号 学校代码 10129
U D C 学号 2009301024
TGF-β1、bFGF 和 PDGF 在奶牛乳腺纤维化中作用的研究
Studies on the Effect of TGF-β1, bFGF and PDGF in Bovine
Mammary Fibrosis
申请人: 丁旭娜
学科门类: 农学
学科专业: 基础兽医学
研究方向: 动物传染病与免疫病理学
指导教师: 王凤龙教授
论文提交日期:二〇一二年四月
摘要
奶牛乳腺纤维化主要是由乳腺炎引起的一种常见的病理过程,而乳腺炎是奶牛
的主要疾病之一,其发病率和感染率在国内外均较高,可引起奶牛乳腺不同程度的
纤维化过程。纤维化的乳腺泌乳量降低,严重时可发展为乳腺硬化导致奶牛淘汰,
给奶牛业造成严重的损失。
组织器官的纤维化过程主要取决于细胞外基质(ECM)的沉积、分解和相关细
胞凋亡等方面,并与转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
和血小板源性生长因子(PDGF)等多种细胞因子密切相关。目前关于肝脏和肾脏
等组织纤维化的研究较多,而有关乳腺纤维化的研究较少,在乳腺纤维化过程中除
间质成纤维细胞产生 ECM 外,乳腺上皮细胞是否能转分化为肌成纤维细胞(MFB)
而产生 ECM 仍不明确。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),结缔组织生长因子(CTGF)
和胶原Ⅰ(COLⅠ)是判断组织纤维化程度的主要指标,因此可通过检测此三项指
标表达量的变化,以确定细胞因子在纤维化过程中的作用。
为在体外培养纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,通过外科手
术的方法采取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织,分离乳腺腺泡,用组织块
培养法体外培养奶牛乳腺细胞,应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮
细胞和成纤维细胞两种细胞分别纯化出来,并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行
鉴定。将不同浓度的 TGF-β1(0,1,5,10ng/ml)、 bFGF(0,5,10,20ng/ml)和
PDGF-BB(0,5,10,20ng/ml)三种外源性细胞因子分别作用于体外培养的奶牛
乳腺上皮细胞和成纤维细胞,于不同的时间点(12h,24h,48h,72h)提取细胞的
总 RNA 和总蛋白,以β-actin 作为内参基因,用 Real-Time RT-PCR 方法测定两种细
胞中α-SMA、CTGF 和 COLⅠα1 mRNA 相对表达量的变化,其 PCR 产物进行测序
分析;并用 Western blot 方法测定相应蛋白的表达。
研究结果表明:纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形,细胞核圆形或椭圆形,
核仁清晰可见,多成鹅卵石样或铺路石样生长,并可分泌乳滴,角蛋白-18 反应阳
性,波形蛋白反应阴性;纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形,成旋涡状或放射
状生长,角蛋白-18 反应阴性,波形蛋白反应阳性。经纯化后两种细胞的纯度均可
达 95%以上,可满足后续试验的要求;外源性 TGF-β1 能够有效上调体外培养的奶
牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞中α-SMA、CTGF 和 COLⅠα1 mRNA 及α-SMA 蛋白
的表达,并成一定的量效关系;外源性 bFGF 对体外培养奶牛乳腺上皮细胞和成纤
维细胞 CTGF mRNA 的表达起促进作用,对成纤维细胞 COLⅠα1 mRNA 的表达主
要起促进作用,对奶牛乳腺上皮细胞 COLⅠα1 mRNA 表达的作用不明显,高浓度
的 bFGF 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞α-SMA mRNA 的表达均有抑制趋势,与
α-SMA 蛋白表达的结果不是很一致。外源性 PDGF-BB 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤
维细胞 CTGF 和 COLⅠα1 mRNA 的表达主要起促进作用;对奶牛乳腺成纤维细胞
α-SMA 蛋白的表达起促进作用,较低浓度时对奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA mRNA
的表达起促进作用;而高浓度时对奶牛乳腺上皮细胞α-SMA mRNA 的表达有抑制
趋势,与α-SMA 蛋白表达的结果不是很一致。经测序分析,奶牛乳腺上皮细胞和
成纤维细胞中目的基因 CTGF、α-SMA 和 COLⅠα1 的扩增产物序列一致,且通过
比对分析得出其扩增产物均为牛的 CTGF、α-SMA 和 COLⅠα1。
研究证实:组织块培养法结合应用差时胰酶消化法和差速贴壁法能够在体外培
养并纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞两种细胞。外源性 TGF-β1
对