文档介绍：中山大学博士学位论文H5N1人禽流感病毒全序列测定与分析及其病毒样颗粒的构建 H5N1人禽流感病毒全序列测定与分析及其病毒样颗粒的构建专业:微生物学博士研究生:周经姣导师:江丽芳教授中文摘要研究背景和目的 H5N1禽流感病毒最早于1959年从苏格兰爆发禽流感的鸡群中分离出。自 1959年以来,H5NI禽流感病毒在禽类中经常引起大范围的流行,造成大量禽类的死亡。1997年,香港首次报道H5NI禽流感病毒跨越宿主屏障直接从禽类传播给人引起严重感染甚至死亡。在其后的几年里,东南亚一些国家相继出现人感染H5N1禽流感病例,特别是近几年来,H5N1人禽流感病例逐年增多,在欧洲、非洲、北美洲和中东等地区的一些国家也出现了人感染H5N1禽流感的病例。 H5N1人禽流感病毒在世界范围内不断扩散并引起高死亡率,因而对于其跨越宿主传播给人的可能原因、致病机制及其防治措施研究成为十分迫切的问题。近几年来,在中国大陆也陆续出现了多起H5N1人禽流感病例。2006年3 月,广东省出现第一例人感染H5N1禽流感病毒并死亡的病例,为了追踪该病毒(A/China/GDOI/06,简写为GDOI/06)的可能来源,探讨其致病机制以及遗传、进化与变异的特征,为研制适合我国人群的H5N1人禽流感病毒疫苗及制定预防措施提供科学依据。本研究从该患者尸检肺组织扩增和克隆GDOI/06全基因组序列,并运用多种生物学软件对GD0I/06及其他H5N1禽流感病毒基因序列进行全面的比对分析。同时构建H5N1人禽流感病毒样颗粒,作为高致病性H5N1 人禽流感病毒的替代模型,以便下一步在普通实验室广泛而安全地开展H5N1人中山人学博十学位论文H5N1人禽流感病毒伞序列测定与分析及j∈病毒样颗粒的构建禽流感病毒结构与功能、抗原性以及病毒与细胞的相互作用等研究。方法应用RT-PCR技术从患者尸检肺组织中扩增GDOI/06全基因组8个基因片段, 将扩增的基因片段分别克隆至I]。测序结果应用 DNAStar软件包qbMapDraw、EditSeq进行编辑和拼接,利用软件包中的Protean 程序分别推导出氨基酸序列,分析GDOI/06核苷酸和氨基酸的改变。并在 ,分析其氨基酸的改变对蛋白结构和功能的可能影响。分别将GDOI/06 8个基因序列在NCBI BLAST Server上进行在线比对,并从 NCBI流感病毒基因组数据库下载各个地区、不同时间、不同宿主分离的H5N1禽流感病毒以及其他流感病毒基因序列,用Clustal X软件进行序列多重比对, 。分析GDOI/06可能的来源,H5N1禽流感病毒的遗传与进化特征。将GDOI/06 HA基因、MI基因的编码区序列分别重组到表达载体 pMT/Bip/V5-His B上。将重组质粒pMT/Bip-M1与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2 细胞,Blasticidin筛选稳定多克隆细胞株。同时将重组质粒pMT/Bip-MI、 pMT/Bip—HA与筛选质粒pCoBlast=质粒共转染果蝇S2细胞,Blasticidin筛选稳定多克隆细胞株。稳定多克隆细胞株培养后加入不同浓度CuS04诱导重组蛋白的表达,分别收集不同诱导时问的培养上清和细胞,、WB、Dot blot、间接免疫荧光等技术检测M1、HA蛋白表达。挑选高表达M1、HA蛋白的稳定多克隆细胞株进行培养,细胞上清浓缩后经蔗糖密度梯度离心纯化,免疫电镜负染观察上清中病毒样颗粒。细胞固定、包埋后制作超薄细胞切片,电镜观察细胞中病毒样颗粒。结果 1、GDOI/06 PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段全长分别为2341bp、2341bp、2233bp、1776bp、1565bp、1399bp、1027bp、875bp。分别将其序列在NCBI BLAST Server上进行比对,GDOI/06 8个基因片段均与 GenBank中H5NI禽流感病毒的同源性最高。基因序列已经投递给GenBank,登中山大学博士学位论文H5N1人禽流感确毒全序列测定与分析及其病毒样颗粒的构建录号为DQ835310、DQ835311、DQ835312、DQ835313、DQ835314、DQ835315、 DQ835316、DQ835317。这是中国最早提交给GenBank的H5N1人禽流感病毒全基因组序列。 2、GDOI/06 HA蛋白在裂解位点处序列为PLRERRRKR/GLF,由6个碱性氨基酸组成。HAl第154~156位处增加了一个糖基化位点,其HA蛋白共有8 个潜在糖基化位点。GDOI/06受体结合部位(RBD)以及受体结合部位左右两缘