文档介绍：流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭(PI)可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇(4℃)、RNaseA、TritonX-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。2、胰酶消化,收集细胞(贴壁细胞)或1000rpm离心5分钟直接收集细胞(悬浮细胞)。3、4℃PBS洗一次,℃PBS,℃的纯乙醇,将枪头伸入液面下,轻轻打入乙醇,轻柔混匀两次,4℃固定过夜。4、1000rpm离心5分钟,去上清,加入染色缓冲液PI染色缓冲液:50μg/%TritonX-100总体积1ml/样品,37℃孵育40分钟。5、1000rpm离心5分钟,小心去除上清,加入1mlPBS,轻柔混匀,300目过滤,上机检测。