文档介绍：第二章基因工程的基本操作程序第二章基因工程的基本操作程序主要包括五个方面的内容: 主要包括五个方面的内容: 1 1、带有目的基因的、带有目的基因的 DNA DNA 片段的制备片段的制备 2 2、、DNA DNA 片段与载体片段与载体 DNA DNA 体外重组体外重组 3 3、、DNA DNA 重组体转入受体细胞重组体转入受体细胞 4 4、、重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定 5 5、、(Target DNA) 制备??制备制备 DNA DNA 片段可通过片段可通过 5 5个途径个途径: : ??1 1、从生物基因组群体中分离目的基因、从生物基因组群体中分离目的基因??2 2、人工合成、人工合成??3 3、、PCR PCR 反应合成反应合成 DNA DNA ??4 4、、mRNA mRNA 差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因??5 5、机械的方法如超声波把基因组打成片段、机械的方法如超声波把基因组打成片段目的基因是目的基因是指准备导入受体细胞的,以研究或指准备导入受体细胞的,以研究或应用为目的所需要的应用为目的所需要的外源基因外源基因。。片段来源: 片段来源: 原核生物和真核生物原核生物和真核生物 1、从生物基因组群体中分离目的基因??主要有以下主要有以下几种方法: 几种方法: ??限制性内切酶法限制性内切酶法(鸟枪法) (鸟枪法) ?? mRNA mRNA 或或 cDNA cDNA 钓取法钓取法(反转录法) (反转录法) A 鸟枪法(霰弹法) 美国塞莱拉遗传公司创始人雷格美国塞莱拉遗传公司创始人雷格· ·文特发明的,是文特发明的,是 20 20世纪最伟世纪最伟大的生物技术发明之一。大的生物技术发明之一。鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序,然后再利用计算机对鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序,然后再利用计算机对这些片段进行排序和组装,重新组装成一个完整的基因组。这些片段进行排序和组装,重新组装成一个完整的基因组。鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组 DNA DNA 片段,然后通过快速有效片段,然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子,进含有目的基因的目的重组子,进而获得目的基因。而获得目的基因。鸟枪法适用于原核鸟枪法适用于原核细菌目的基因的细菌目的基因的克隆分离克隆分离染色体的切断染色体的切断与载体连接与载体连接转化受体细胞转化受体细胞筛选含目的基因的重组子筛选含目的基因的重组子鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 1 1、染色体、染色体 DNA DNA 的切断的切断超声波处理: 超声波处理: 片段长度均一,大小可控,平头末端片段长度均一,大小可控,平头末端全酶切: 全酶切: 片段长度不均一,粘性末端便于连接片段长度不均一,粘性末端便于连接, , 但有可但有可能使目的基因断开,大小不可控能使目的基因断开,大小不可控部分酶切: 部分酶切: 片段长度可控,含有粘性末端, 片段长度可控,含有粘性末端, 目的基因完整目的基因完整与载体连接与载体连接??如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择法筛选,则选择多拷贝克隆载体多拷贝克隆载体; ; ??如果采用基因产物功能检测法筛选,则如果采用基因产物功能检测法筛选,则选择选择表达型载体表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选, 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选, 则选择则选择大肠杆菌作为受体细胞大肠杆菌作为受体细胞; ; 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的选择能使目的基因表达的受体细胞基因表达的受体细胞转化受体细胞转化受体细胞??筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立) 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立) 鸟枪法操作的改进(一) 鸟枪法操作的改进(一) 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体 DNA ,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体 DNA ,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组