文档介绍：中南民族大学
硕士学位论文
抗真菌放线菌的分离和鉴定及抗稻瘟病病菌生物活性的研究
姓名:唐颜苹
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:李晓华
20100501
中南民族大学硕士学位论文
摘要
由病原菌引起的植物病害是农业生产中发生普遍、危害严重的一类病害。本
次研究从湖北省神农架周边地区,以不同海拔、不同土壤类型、不同生态环境以
及周边典型代表植物为采集土样的标准,用传统的平板稀释法,在高氏 1 号培养
基中加入 K2Cr2O7 作为杂菌抑制剂,分离所采集的土样中的放线菌。共分离得到
800 株放线菌。分别以植物病原真菌为指示菌,采用菌块法对 322 株放线菌进行
筛选,确定有 221 株菌株具有至少抗一种真菌的生物活性。其中 167 株放线菌有
抗稻瘟病病菌的生物活性,119 株放线菌有抗棉黄萎病菌的生物活性,151 株放
线菌有抗立枯丝核菌的生物活性,125 株放线菌有抗禾谷镰刀菌的生物活性,130
株放线菌有抗葡萄灰霉病菌的生物活性。
本试验分离出来的具有抗真菌活性强、抗菌谱广的放线菌中有两株菌株
ⅡB21、Ⅱ R21 具有抗很强的抗稻瘟病病菌的生物学活性,根据菌株的培养特征、
形态学特征观察、16S rDNA 序列及其系统发育树分析,初步确定菌株ⅡB21 和
菌株ⅡR21 均为链霉菌属。摇瓶发酵结果表明,菌株ⅡB21 和菌株ⅡR21 的发酵
液具有较强的抑制稻瘟病病菌生长的生物活性。为了提高抗菌活性物质的产量,
对其发酵培养基以及发酵培养时间进行优化,菌丝体培养基为最佳发酵培养基,
30℃、180rpm 摇床培养为较佳发酵条件。
采用杯碟法分别测定 24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h 发酵
液的抗稻瘟病病菌的生物活性,抑菌圈直径的数据表明,菌株ⅡB21、ⅡR21 发
酵液的次级代谢活性物质随发酵时间的延长而逐渐增加,并于 120h 时菌株
ⅡB21、ⅡR21 抑菌活性达最大值,抑菌圈直径分别为、,随
后抑菌直径随抑菌时间的延长而减小,因此这两株菌株的最佳发酵时间以 120h
为宜。
对菌株ⅡB21、ⅡR21 活性物质的理化性质进行测定,分别取适量的发酵液
滤液在 4℃、室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴
锅中温度处理 2h 以及在立式高压灭菌锅内 121℃的条件下分别处理 20min、
30min,待自然冷却至室温后分别用杯碟法测定其抑菌活性,结果表明 30℃~70℃
I
抗真菌放线菌的分离和鉴定及抗稻瘟病病菌生物活性的研究
范围内处理的发酵液滤液的抗稻瘟病病菌的生物活性均没有明显变化,但当温度
高于 90℃时菌株ⅡB21、Ⅱ R21 的发酵液滤液的抗稻瘟病病菌的生物活性明显降
低,甚至丧失抗菌活性。
用浓度为 HCl 和 NaOH 分别调节菌株ⅡB21、ⅡR21 的原
始发酵液滤液的酸碱度,使其最终的 pH 值分别为、、、、、、
、、,4℃条件下处理过夜后,再分别将滤液的 pH 值依次调至原始发
酵液滤液的 pH 值,研究表明活性物质在 ~ 范围内比较稳定,在强酸或
强碱的条件下其抗菌活性明显减弱,甚至丧失抗菌活性。
根据菌株ⅡB21、Ⅱ R21 发酵液的活性物质在 30℃~70℃、~ 范围内
的稳定性,分别将其发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取,再用无水硫酸钠脱水过夜,
再经旋转蒸发后得到活性物质的粗提物,用少量的丙酮溶解回收后放 4℃保存备
用。以正丁醇、乙酸、水(体积比为 3:1:1)做展开剂系统,经薄层层析后(GF254),
样品在三用紫外分析仪(UV-254nm)下观察,菌株ⅡB21、ⅡR21 发酵液粗提物
样品都有荧光带,并且信号较强。
关键词:植物病原真菌;放线菌;生物活性;筛选;16S rDNA;鉴定

II
中南民族大学硕士学位论文
Abstract
The plant disease characterized by pathogenic bacteria infection has been
reported in numerous literatures since it has the great detriment to agriculture. The
purpose of this study is to establish a standard for the soil sample