文档介绍：microRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA,位于基因组非编码区,本身不具有开放阅读框(openreadingframe,ORF),具有高度保守性,时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中,不编码任何蛋白质,长度仅为20~24nt。成熟的miRNA5′端有一个磷酸基团,3′端为羟基,由具有发夹状结构的约70~90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-plex,RISC)作用于靶点mRNA,通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。       最近有研究指出,miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用,同时,miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程,因此,非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。        目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析,微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitativeReal-TimePCR)。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。1、Northern印迹分析(NorthernAnalysis)       Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法,它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行,大部分实验室都可以进行操作,不需要额外的资金投入与设备更新。不足之处:1)Northern分析的过程涉及大量人工操作,并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交,因此,它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此,在简单探究miRNA功能机理的实验中,Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。2)Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级,这就引发了一个严重的问题,进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围,例如,能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。另外,由于Northern印迹以杂交为原理,它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如,同一个家族中的miRNAlet-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异,导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外,Northern印迹实验的重复性较弱。3)Northern印迹耗时,耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日,不仅减慢了实验进程,也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外,Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA,增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度,甚至无法顺利开展实验。2、微点阵(Microarray)分析       微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA,它通过测定特定过程中miRNA的表达水平,来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交,通过荧光扫描获得表达图谱,借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列,因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。不足之处:1)微点阵仍