文档介绍：microRNA ( miRNA )是一种机体内源性表达的单链小分子 RNA ,位于基因组非编码区,本身不具有开放阅读框( open reading frame , ORF ),具有高度保守性, 时序性和组织特异性。 miRNA 广泛存在于各种真核细胞中,不编码任何蛋白质, 长度仅为 20~ 24nt 。成熟的 miRNA 5′端有一个磷酸基团, 3′端为羟基,由具有发夹状结构的约 70~ 90nt 的单链 RNA 前体经过 Dicer 酶加工后形成。成熟的 miRNA 形成 RNA 诱导的基因沉默复合体( RNA -induced plex , RISC ) 作用于靶点 mRNA ,通过对 mRNA 剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确 miRNA 及其靶 mRNA 之间的作用机制。最近有研究指出, miRNA 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用,同时, miRNA 参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程,因此,非常有必要开发有效的实验工具来测定 miRNA 。目前检测 miRNA 的方法主要有 Northern 印迹分析,微点阵( microarray )分析和实时定量 PCR ( quantitative Real-Time PCR )。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。 1、 Northern 印迹分析( Northern Analysis ) Northern 印迹是基于杂交检测 RNA 的常用方法,它是最早用于 miRNA 分析的几种方法之一。这种方法简单易行,大部分实验室都可以进行操作,不需要额外的资金投入与设备更新。不足之处: 1) Northern 分析的过程涉及大量人工操作,并且每次仅有一条 miRNA 探针与一个 RNA 印迹杂交,因此,它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此,在简单探究 miRNA 功能机理的实验中, Northern 印迹分析还是能够满足研究需要的。 2) Northern 印迹分析的动态范围只能达到两个数量级,这就引发了一个严重的问题,进行实验的细胞内的 miRNA 分子的数量要达到比较大的范围, 例如,能够检测 40,000 个 miRNA 分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测 10个 miRNA 分子每细胞。另外,由于 Northe rn印迹以杂交为原理,它通常不能有效区分具有细微序列差异的 miRNA 。例如,同一个家族中的 miRNA let-7c 与 let-7 a 和 let-7b 之间仅有一个碱基的差异,导致 Northern 印迹分析无法清晰区分它们。此外, Northern 印迹实验的重复性较弱。 3) Northern 印迹耗时,耗量。进行一次 miRNA 检测需要 3个工作日,不仅减慢了实验进程,也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外, Northern 印迹大概需要 5到10微克的总 RNA 量上样量才能成功检测出 miRNA ,增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度,甚至无法顺利开展实验。 2 、微点阵( Microarray )分析微点阵分析也是基于杂交的原理来检测 miRNA ,它通过测定特定过程中 miRNA 的表达水平,来分析了解 miRNA 的表达调控机制以及由 miRNA 调