文档介绍：浙江大学
硕士学位论文
CD19新克隆ZCH-4-2E8鼠Ig VH和VL基因克隆及测序鉴定
姓名:张玲燕
申请学位级别:硕士
专业:儿科学
指导教师:汤永民
20040501
新克隆·驣蚔蚩寺〖安庑蚣中文摘要儿科学R褐琢鲅汤永民教授重威胁儿童健康的顽症,目前主要的治疗手段是抗肿瘤药物的联合化疗。尽管联合化疗的应用明显改善了儿童的预后,但常规化疗在白血病细胞和正常细胞发,或大剂量化疗的严重毒副作用,如严重感染、出血、重要脏器功能衰竭等而告治疗失败。自从年发现了单克隆抗体技术和不久后提出生物导弹设想以来,导向治疗受到许多科研工作者的关注。与化疗比较,导向治疗具有良好的选择性,抗进行临床导向治疗可以发生严重的血清病或因产生人抗鼠免疫球蛋白抗体们在临床上的有效应用。应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因,可以大大降低鼠单抗的免疫原性而保留其识别抗原的能力。而要研制基因工程抗体,%,在髓系细胞、红系细胞、赴凸撬韪上赴约胺窃煅F鞴僮橹显蛭薇泶铩因此,如采用抗人抗体导向的生物治疗可以降低化疗的非特异性毒副作用。简称固是本实验室研制的经国际鉴定为特异性识别抗原的单抗,并正式纳入了国际命名系统。,采用克隆体系等一系列分子生物学技学浙江大学医学院专业:硕士研究生:张玲燕急性赴园籽2礎嵌R合低匙畛<亩裥灾琢觯茄之间的选择性较差,毒副作用大,许多患儿因产生了耐药的白血病细胞而导致复它只杀伤表达靶分子的细胞,而不损伤无靶分子表达的细胞,从而大大降低药物的全身毒副作用。但是,目前大多数高亲和力的单抗属于鼠源性的,用鼠源性单,┪锏目拱籽2∽饔玫任侍猓拗屏怂鼠源性抗体可变区基因的克隆与测序是关键。院:导师:浙江土学嘎士学位论文—
术进行鼠、基因克隆和测序,为进一步研制蚬こ炭固宓於ɑ 材料与方法细胞复苏后常规培养于含湿度。流式细胞仪鉴定其抗体亚类和对标准单抗的阻滞作用。鄊掷胂低炒炕痬W贤夥止夤舛燃撇舛≧浓度。孀B家痪酆厦噶捶从—融扩增—秒,。由,再加入普通琼脂糖电泳鉴定铩寺『湍康幕虻牟庑颍呵碇巧螪片段纯化回收,与单抗流式细胞仪鉴定:固逖抢辔狪茏柚捅曜嫉タ笴小约哪康奶醮ǘ砸镌诟迷咏涣龅娜诤隙韵驨鼠骨髓瘤细胞模板中未扩增出相应条带。轻链引物和号在赴模板中未扩增出相应条带。甖一杂交瘤细胞复苏培养与流式鉴定:%小牛血清的一完全培养液,培养条件为。%⒈ズ躌的抽提及纯化:~步法抽提赴躌,和基因:孀B糾水浴分钟。┰鯲蚔颉7从体系为¨琹¨0澹琁弑U鎀酶,7从μ件是。と分钟,进行个循环变性秒,。嘶连接过夜,转化至感受态大肠杆菌,蓝白筛选,提取质粒,盖屑ㄋ筒庑颉~籽2∠赴慕岷稀细胞ǘ炔舛ǎ鹤躌痷,.甊狿扩增结果:重链引物和号在赴鹀0逯欣┰龀龃模板中扩增出大小约哪康奶醮枚砸镌贜细胞延伸分钟。%结果晰江土学埙士学位论文/.
话被嵛;ゲ咕龆ㄇ,狥,~位氨基酸为,~位氨基酸为位氨基酸为。霭被幔ü驶チM焖鹘峁允荆~位氨基酸为甌寺。单抗重、轻链可变区基因克隆至⑩采用ッ盖兄刈橹柿,并经%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示,单酶切可以切出大约奶醮っ髦亍⑶崃纯杀淝蛞丫隆到测序质粒中。重、轻链可变区基因及其氨基酸的序列分析:蛉ǔ编码霭被幔驶チM焖鹘峁允荆簂~位氨基酸为框架区其中第和位为特征性的半胱氨酸基因全长嗦位氨基酸为,~位氨基酸为话被嵛狢~位氨基酸为话被嵛狢F渲械话被酸为特征性的结成功地完成了抗人新克隆—驣和基因的克隆与测序,为进一步研制蚬こ炭固宓於嘶亓纯杀淝蚱纬ざ任,编码霭被帷崃纯杀淝蚱纬ざ任,编码霭被帷论浙江土学硕士学位论文中,
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驴寺—驣蚔蚩寺〖安庑蚣硕士研究生:儿科学R褐琢鲅源性单抗对人体的免疫原性。现知,抗体的免疫原性主要位于抗体恒定区段,学专院:业:师;浙江大学医学院张玲燕汤永民教授前言白血病是小儿时期最常见的恶性肿瘤,岁以下儿童白血病的发病率为万左右,约占该时期所有恶性肿瘤的%。其中急性淋巴细胞性自血病在儿童占%左右。联合化疗的应用明显改善了儿童脑ず螅醮位航饴士达%以上,目前发达国家的五年无病生存率汛ヒ陨希诘奈年泊锏搅ヒ陨稀5杂ァサ幕级虬籽2「捶⒒蚧聘弊用而死亡。他们不能长期生存的原因之一,就是常规化疗在白血病细胞和正常细胞之问的选择性较差,毒副作用大,难以采用足够的剂量来杀灭体内所有的白血病细胞:而且反复的非根治性剂量的化疗,又容易诱生白血病细胞的耐药。最终,许多患儿因产生了耐药的