文档介绍：山东农业大学
博士学位论文
注射圆形精子细胞的山羊卵母细胞激活和胚胎发育的研究
姓名:刘新勇
申请学位级别:博士
专业:动物遗传育种与繁殖
指导教师:谭景和
2011-06-14
山东农业大学博士学位论文
中文摘要
卵母细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)作为治疗严
重少弱精子症病人的有效方法,现在已经被广泛应用于临床,并出生了大量 ICSI 受精
试管婴儿。在临床上,仍有部分非梗阻性无精子症病人无法产生正常的成熟精子,但
可以从其精液或睾丸活检标本中回收到圆形精子细胞(round spermatid,ROS)。已经
证明,ROS 作为最早的单倍体雄性生殖细胞将其显微注射到卵母细胞后可以形成雄原
核并参与配子配合。因此,圆形精子细胞注射(Round Spermatid Injection,ROSI)在
临床上作为治疗男性不育的一种新手段,为那些因为不能产生成熟精子而不育的男性
提供了生育自己遗传学子女的机会。目前,虽然已经出生了 ROSI 试管婴儿,但是
ROSI 仍然存在受精率低,后代出生率低等问题。主要原因可能在于 ROSI 后卵母细胞
不能激活;ROS 携带的中心体功能不完善或异常,不能在卵母细胞内充当微管组织中
心;ROSI 后圆形精子细胞核在卵母细胞内重塑异常等。因此,需要深入研究这些问
题,以期望改善 ROSI 受精效果,更好地为人类辅助生殖临床服务。另外,分析 ROS
不能激活卵母细胞的原因,研究 ROS 携带的中心体在卵母细胞内组织微管的能力以及
圆形精子细胞核在卵母细胞内的重塑情况,对丰富受精时卵母细胞激活机制的内容,
阐明中心体在受精中的作用,以及精子形成时精核致密化的作用都具有重要意义。
本研究利用 ROSI 技术,免疫荧光技术,激光扫描共聚焦显微术,蛋白激酶活性分
析等技术,以山羊 ROS 和体外成熟的山羊卵母细胞为实验材料,主要研究了山羊圆形
精子细胞卵胞质内注射后支持胚胎发育的能力,并从以下几个方面详细分析了圆形精
子细胞不能支持胚胎发育的原因:(1)圆形精子细胞卵胞质内注射后卵母细胞激活情
况,(2)圆形精子细胞卵胞质内注射后 MPF 和 MAPK 活性变化情况,(3)圆形精子
细胞卵胞质内注射后钙振荡情况,(4)山羊圆形精子细胞对小鼠卵母细胞的激活能力
和引发钙振荡情况,(5)多个山羊圆形精子细胞对山羊卵母细胞的激活能力和引发钙
振荡情况。另外,本文还比较了成熟精子和圆形精子细胞核在卵母细胞内的重塑情
况,观察了圆形精子细胞中心体在卵母细胞内组织微管的情况,并优化了山羊 ROSI 卵
母细胞激活方案。主要试验结果如下:
%的卵母细胞卵裂,并且不能发育
到囊胚,ICSI 后卵母细胞的卵裂率和囊胚率分别为 %和 %,说明山羊圆形精子
细胞不能支持胚胎发育。
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注射圆形精子细胞的山羊卵母细胞激活和胚胎发育的研究
后 %的卵母细胞被激活,而 ROSI 后仅有 %的卵母细胞被激活,
这一激活率显著低于 ICSI 组的激活率,说明山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后胚胎不
能发育的原因是由于山羊 ROS 不能激活卵母细胞。
Ionomycin 处理能显著改善卵母细胞激
活;山羊 ROS 能在激活的 ROSI 卵母细胞内形成雄原核(MPN)。
后山羊卵母细胞的第二次减数分裂核进程为:0- 为 M II 期,-
为 Ana II,- 为 Tel II, 以后为 PN 期。
后和 ROSI 后用 Ionomycin 激活处理,卵母细胞内 MPF 和 MAPK 活性显
著下降,而 ROSI 后卵母细胞内 MPF 和 MAPK 活性几乎不发生变化,说明山羊圆形精
子细胞卵胞质内注射后卵母细胞不能激活的原因是 MPF 和 MAPK 活性不下降。
2+
,ROS 不能引起卵母细胞内[Ca ]i 升高,
2+
ROSI 后 Ionomycin 激活仅在激活处理时出现[Ca ]i 升高。说明山羊 ROS 卵胞质内注射
后不能引起卵母细胞内钙振荡是 MPF 和 MAPK 不能灭活的原因,并由于这一原因最终
导致卵母细胞不能激活。
ROS 能够激活小鼠卵母细胞并能引发小鼠卵母细胞内钙振荡,说明山羊