文档介绍：放射免疫分析技术
(Radioimmunoassay,RIA)
核医学
治疗:肿瘤、甲亢等
诊断体内——PET、SPECT、
放射免疫成像等
体外——放射免疫分析(RIA)
标记免疫分析技术
用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法
特点:敏感性高,反应时间短,可用仪器检测结果
三大标记免疫分析技术:放射免疫、荧光免疫、酶免疫
检测方法检测范围
生化、常规免疫 mg~μg(10-3 ~10-6 g)
荧光免疫、酶免疫μg~ng(10-6 ~10-9 g)
放射免疫、发光免疫 ng~pg(10-9 ~10-12 g)
PCR pg~fg(10-12 ~10-15 g)
一、放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RIA)
女科学家 (美,1921~)1950’末
发明(胰岛素),1977年获诺贝尔医学奖
1. 基本原理
(1)竞争结合分析:Ag + Ab AgAb
*Ag + Ab *AgAb
(2)IRMA(免疫放射分析):
2. 常用标记核素:
(1)125I: γ射线,半衰期 60 天
(2)3H: β射线,半衰期 年
3. 测量仪器
(1)γ计数仪
(2)β液闪仪
4. 基本试剂
(1)标准品与质控品
a. 意义:放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据
b. 要求:
化学结构上——与待测物有相同的化学结构
化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低
含量准确
注意不变质与降解:在运输、保存时尤应注意;注意有效期
c. 种类:国际标准物
a. 对标记物的要求
比活度高:即单位物质的放射性强度高
生物活性及免疫活性与标记前改变小
放射化学纯度高:应> 95%
稳定性好:标记的同位素不易脱落
b. 标记方法:
氯胺-T 法:最常用的 125I 标记法,I 与酪氨酸共价结合,方法简便,但易造成蛋白质的损伤
乳过氧化酶法:
Iodogen(氯甘脲)法:固相法,标记率较高,损伤小,反应时间长
置换法: 3H 最常用
c. 标记产物的纯化:常用 Sephadex 层析,也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离
d. 标记产物的鉴定:常用 RIA 法
最大结合百分率
标准曲线比较法
e. 半抗原的标记:必须先连接载体,常用牛血清白蛋白(BSA),再对载体作标记
(3)特异性结合抗体
a. 对特异性结合抗体的要求:
亲和力(affinity)高:指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力,用 K 值表示,反映灵敏度
特异性高:与待测抗原的结合力高,而与待测抗原类似物的结合能力(交叉反应)低
滴度(效价)高:指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高
稳定性好:能长期保存,化学性质、效价稳定
b. 抗体的制备
选择合适的免疫动物:兔、鼠、羊
应用佐剂:福氏完全佐剂与不完全佐剂(羊毛脂、石蜡油+卡介苗)
选择合适的免疫方法:剂量、接种途径(腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点)、间隔时间(加强)与次数
c. 抗体的纯化
去除杂抗体:用抗原吸附法
提取特异性 IgG:先用盐析法粗提,再用离子交换层析或亲和层析纯化
d. 抗体的鉴定
鉴定内容:效价、亲和力、特异性
鉴定方法:效价(琼脂单扩)、特异性(琼脂双扩)、RIA
e. 单克隆抗体的使用:
用于 IRMA 或 RIA,特异性高
不一定优于传统的多克隆抗体
5. 竞争性放射免疫分析法的建立
(1)反应方式
a. 平衡法:标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育
b. 顺序法:先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度
c. STAT 法:反应未达平衡时即测定,较难控制反应条件
(2)反应体系
a. 缓冲液:常用 ~ mol/L pH ~ 磷酸或 Tris-HCl 缓冲液。根据需要定
b. 反应体积:小体积可提高灵敏度,但增大了误差
c. 反应时间:
d. 反应温度:
e. 反应物比例:减少抗体与标记的用量可提高灵敏度;增加抗体与标记的用量可扩大测定范围