细胞免疫荧光实验步骤.doc

文档介绍：细胞免疫荧光实验步骤————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: 细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:-.-20度甲醇固定20分钟后,自然、:3min*%Triton:+:2*:37度,,his1;4004度过夜,一般要大于18小时或者37度 1- PBS洗净,3min* 37度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽(100ug/ml储存液)室温染色30- PBS洗净,3*5minDAPI1:200 凉干封片() 我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤:1)辐照结束后,弃去旧培养液,4%多聚甲醛4℃固定15分钟。2)PBS洗涤,5分钟×3次。3)%Triton-X1004℃破膜15分钟。4)PBS洗涤,5分钟×3次。5)羊血清工作液室温封闭2小时。6)PBS洗涤,5分钟×3次。7)µg/ml一抗(梯度1:5001:7501:1000)37℃孵育细胞2小时。8)PBS洗涤,5分钟×3次。9)µg/ml二抗(1:200)37℃避光孵育细胞1小时。10)PBS洗涤,5分钟×3次。11)1µg/mlDAPI染色15分钟,使用时避光。12)PBS洗涤,5分钟×3次。13)以及分数90%甘油封片,盖玻片细胞面朝下。14)荧光显微镜下观察。活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备(一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106~1×107/ml ↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇↓ 4℃30min 用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入 1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察, 视细胞浓度加入100~500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5~7天)(二)试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。 3. 10%FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项 1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。附: (×10,贮存液) NaCl80g KCl2g 蒸馏水加至1000ml ∶10稀释 KH2PO42g 2. 洗涤液 DPBS 900ml FCS50ml(终浓度 5%) 4%NaN3???50ml(%) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g(终浓度2%) 甲醛 10ml NaN3 (%)4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项 1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。附: (×10,贮存液) NaCl80g KCl2g 蒸馏水加至1000ml ∶10稀释 KH2PO42g 2. 洗涤液 DPBS 900ml FCS50ml(终浓度 5%) 4%NaN3???50ml(%) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g(终浓度2%) 甲醛 10ml N