文档介绍：第卷第期中国预防兽医学报.. .
年月.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量
—方法的建立与应用
刘长龙,张建武,韦祖樟,袁世山
中国农业科学院上海兽医研究所猪呼吸系统疾病研究室,上海
摘要:为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒,本研究针对的蛋白基因保守序列,设计
特异性引物和探针,以体外转录的作为标准品,设计并优化了检测的荧光定量
方法。应用该方法检测其它主要猪病病原,结果均呈阴性;针对阳性的检测灵敏度可以达到
拷贝,比常规灵敏倍~ 【】倍;结果表明,本实验建立的荧光定量方法具有良好
的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量,免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第
血清中病毒的载量差异不显著,而在第差异显著,免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。
关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;荧光定量;探针; 标准品
中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:———
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猪繁殖与呼吸综合征产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败
,,首次发现于二十世纪血症等症状,给养猪业造成重大损失⋯。属
八十年代末,其病原为病毒。以怀于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,其基因组为单股
孕母猪和月龄以内仔猪最易感,能够引起母猪流正链,全长为左右,具有个开放阅读

收稿日期:.一
基金项目:十一五支撑项目】
作者简介:刘长一,男,山东平度人,博士研究生,主要从事预防兽医学研究
通信作者::..
第】期刘长龙,—方法的建立与应用
框,’末端为非编码区和帽子结构,’末端为非编的引物,—:
码区和尾。该病毒分为欧洲型和北美型, 一’~ ;—:
其中,欧洲代表株为,北美代表株为一’~.
.。郭宝清等于年首次报道我国爆发目的片段为。引物和探针均由上海超世生物
该病并分离得到病毒株—,经鉴定为北美型。科技有限公司合成。
自年起,我国大部分地区流行高致病性变异. 病毒提取和的合成法提
,可见建立该病毒的快速检测方法是预防取阳性血清中的。反转录程序为:
和控制高致病性的重要手段。℃, 。
国内关于检测的报道虽然采用荧光定量. 标准品的制备以./—为
的方法,但均以重组质粒作为标准品,容易造成定引物,扩增模板,产物经纯化连接到
量的结果与实际病毒量存在偏差,而以做标—载体中,转化感受态细胞。阳性重组
准品可以直接定量到病毒拷贝数,避免这些不足。质粒经鉴定后,由上海英骏公司测序。阳性
本研究针对北美型毒株蛋白基因序列设重组质粒经酶切产物以
计了一对特异性引物和探针,以体外转录进行纯化,纯化产物按照
的作为标准品,绘制标准曲线,设计并优化进行操作。经纯
了检测的荧光定量方法。化,测定浓度后,计算标准品的拷贝数,并以倍
系列稀释标准品至下限为/.。
材料和方法. 反应体系的优化相同浓度模板的反应体系
中,采用矩阵法优化引物和探针的最佳浓度。同时
. 病毒株和细胞猪圆环病毒型、在荧光定量—反应条件中,选择最
高致病性毒株、日本乙型脑炎病毒佳退火温度