文档介绍：中国农业科学院学位论文猪源B急镜募ḿ坝ü舛縋检测方法的建立教单位:上海兽医研究所究养密级:论文编号:硕士研究生:侯军委指导师:童光志申请学位类别:农学硕士业:预防兽医学方向:兽医微生物及其分子生物学研究生院提交日期月专研培痭
.痭·篐畐篜甌猌:篤一
桫及鬻淞\√圳辩匆嘲甥辞研赫歹彳易易·鑫秀妇废专业℃中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表伊专业童光志研究员单论文题目猪源B急镜募ḿ坝ü舛縋检测方法的建立论文作者侯军委预防兽医学研究方向指导教师培养单位芯克⒅行姓名职称位蔡雪辉研究员哈尔滨兽医研究所阅赵启祖中国兽医药品监察所教授浙江大学微生物学秦爱建扬州大学兽医微生物学’于圣青上海兽医研究所副研究员委会议记录厥论文答辩时间地点年眨虾J抟窖芯克鵄评人蓉辩主周继勇席答刘光清周艳君顾惠明~贝口’●‘
一躲铱耀√帆俐哪渺研究生签名:榛胛时间:们//;年庐刁杪独创性声明关于论文使用授权的声明时间:乒移∥年∥月易泊本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。导师
本研究利用本实验室构建的含有删基因组三种不同拷贝数的质粒含有摘要如断奶猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾炎综合症等,因此,研究猪源订杂谠し榔淝痹诘闹⒂捎诨姑挥姓业绞屎显谔逋馀嘌鴑’南赴担浠蜃榻峁辜案粗谱B蓟粕胁磺宄个疺蜃榭奖吹膒载体渥H局琳攀细蜗赴∈焙螅崛∽片段剪接而来的,这两个基因片段分别位于蜃榈和希琌属于环病毒科指环病毒属成员,为单股、环状、负链的《荆正面体对称结构,无囊膜。人源疺基因组大小约为,猪源痸约。到目前为止,尚未发现猪源肴魏我恢种聿∮斜厝涣O担怯胍恍┲聿〉姆⑸幸欢ǖ南喙匦裕病性有重要意义。Ⅳ”痸蜃榭奖吹膒载体的肈渲锌赡艽嬖诘腄,然后利用预测的阅读框、、的扩增引物,确证其中的丫删弧经反转录后,用这三对引物扩增目的基因片段,经克隆和测序,结果发现:确实发生了转录,但转录产物并非全长序列,而是在’基因组的至处发生了黾罨募羟校艚雍蟮膍嗦肭蛄腥ǔの,这是之前没有预测到的;由于被包含在之中,因此,我们尽管扩增出了条带,但仍不能确定其是否发生了转录,然而,通过序列比对发现,这个可能转录的阅读框并没有发生剪切;确实存在,而且通过序列比对发现,确实像被预测的那样是由两个基因的全长序列大小为籓诒辉げ獾募艚臃绞降幕∩嫌纸徊椒⑸肆街中问降募艚樱一种剪接发生在基因组的Γ羟辛艚雍蟮膍嗦肭蛄腥ǔ为硪恢旨艚臃⑸痸蜃榈Γ羟辛艚雍蟮膍码区序列全长为佣肆礁鲂碌脑亩量颍颐墙耙恢旨艚臃绞讲脑亩量虺莆,将后一种剪接方式产生的阅读框称为。进一步分析发现,、、的剪接方式皆完全符合’嬖颍鳲募艚硬⒚挥邪凑照庖还嬖蚪小⒎直鹪鬺和’的蛘页鲆欢渭雀叨缺J赜指叨忍匾斓暮塑账嵝蛄校笮分别为,将两片段核苷酸序列克隆至甌载体上,分别转化至态细胞,扩增后提取质粒,制备阳性标准品。分别在和的上述区域设计引物和探针。经优化反应条件,绘制标准曲线,分别建立了针对和’的荧光定量觳夥法。标准曲线的相关系数为,标准曲线的相关系数为。此两种方法的最低检出量均可达,碓痸外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性,批内和批间重复性试验变异系数均小于ァ@媒立起来的两种荧光定量觳夥椒ḿ觳獠杉怨阄骱湍诿晒诺莶×希峁允荆琓疺的阳性率为.%,痸粜月饰ィ和混合感染的阳性率为.%。病料中恳话阍/洌/洹V碓痸检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。⒈狙芯拷玂谋砦桓患和全长分别克隆到蘬惺靥迳希/
关键词:猪源订琌,荧光定量嗫寺】固重组质粒在细胞中高效表达。其中,泶锍霭逍问降闹刈榈鞍祝体经超声波破碎和包涵体洗涤液纯化后获得了高纯度的纯化蛋白。而表达的可溶性重组蛋白利用镍离子亲和柱纯化后获得同样高纯度的纯化蛋白。将上述两种纯化后的重组蛋白免疫/∈笾票赋鱿嘤Φ亩嗫寺】固澹嗫寺】固寰璄检测效价可达,为进一步研究、的亚细胞定位和功能、感染性克隆的构建、病毒的分离等提供了良好的工具。Ⅱ
﹙甌/此Ⅵ..甌,鰉’.;籓琣.,,.,,瑆。.籓簅甋,..瓺’.ィ瑆籘
...%,.%.%’,,。.//痝/甌·..,甌/瓵
目录第一