文档介绍：第一军医大学
硕士学位论文
青蒿素诱导K562细胞凋亡的基因表达谱研究
姓名:丁大鹏
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:马文丽
20060609
1
2
青蒿素诱导细胞凋亡的基因表达谱研究硕士研究生:丁大鹏指导教师:马文丽教授摘要药物,其治病机理是青蒿素能够与单细胞疟原虫内部高浓度的铁离子发生反应,产生自由基类的带电原子,后者可以攻击疟原虫细胞膜,导致疟原虫细胞被杀死。而肿瘤细胞分裂时也需要大量铁离子才能进行复制,研究发现肿瘤细胞内铁离子含量远远高过正常细胞,因此可以考虑将青蒿素用于抗肿瘤治疗。制增加铁的摄取,同时降低细胞内铁的利用。相反,当细胞内的铁过量时,细就会与细胞内高浓度的铁离子发生反应,反应使得青蒿素分子内的过氧桥结构可交联脂质或蛋白质,而药物本身也能烷化肌动蛋白,甘油醛磷酸脱氢酶及腺硕士学位论文青蒿素是从中药植物青蒿中提取出来的一种化合物。作为治疗疟疾的首选铁离子在细胞内处于高度的平衡状态,当细胞缺铁时,细胞通过一系列机胞便主动降低铁的摄取,并上调铁的利用效率。铁的平衡是依赖转铁蛋白,转铁蛋白受体和铁蛋白的共同调控来实现的。青蒿素首先和血液内的转铁蛋白结合,后者被细胞表面的转铁蛋白受体运送到细胞内,一旦青蒿素进入细胞后,裂解产生活性自由基。后者作为一种强烷化剂,极易攻击生物大分子,能直接作用细胞膜或者氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸,同时反应产生的丙二醛等物质苷三磷酸酶等,导致细胞损伤;同时考虑铁离子是肿瘤细胞复制时所必需的重
3
要物质,青蒿素作用分裂期的肿瘤细胞,可以通过与细胞内的铁离子发生反应,影响肿瘤细胞的复制,并且彩且资茏杂苫颓椎缱踊衔锕セ鞯拇蠓肿樱因此理论上可能也是这类药物抑制肿瘤细胞生长的机制。有研究报道,通过细胞膜离子通道的作用,提高肿瘤细胞内的铁离子浓度,药物可以抑制多种肿瘤细胞的生长,包括肝癌细胞株,.,鲋辏琀赴斯卑〩赴说头只圩瓷掀け茄拾〤一和细胞株,肉瘤细胞等的生长并诱导上述细胞凋亡。也有研究报道,在整体动物实验中噍锼乩嘁┪锟梢种坡闶蟮母伟┫赴鸅纳ぁ更由于青蒿素与铁离子结合的专一性,对正常细胞的生长没有影响,因此被认芯片研究青蒿素对体外培养的人红白血病细胞作用后基因表达的改变,通过对芯片探针荧光信号值的数据进行分析,找出青蒿素作用前后细胞的差异表达基因,然后结合生物学软件研究差异表达基因的不同类别和生物学通路中的具体作用,从而在基因水平上对青蒿素抗肿瘤的具体作用机制进行研究,为后续的药物临床研究与开发提供实验依据。实验研究分为两个部分:首先从基因表达谱芯片实验的技术角度,研究两种杂交环境对芯片杂交效果的影响。实验应用限制性荧光标记方法标记人红白血病细胞,将样品在流动态与传统静置态两种环境中分别与基因表达谱芯片进行杂交,并在同等条件下进行杂交后的清洗和芯片扫描检测,应用煅榈韧臣蒲Х椒ǚ治霰冉杂交后探针的荧光信号值,探讨两种方法对杂交信号的影响。研究发现,样品交结果背景高,阳性探针信号相对弱,并且信噪比低。同时,从液体与固体接触后的流体动力学角度来进行研究,由于样品在一个封闭的环境里,通过不断摘要然后引入青蒿素,可以有选择性的杀死肿瘤细胞。我国学者也发现,青蒿素类为是很有应用前景的一种抗肿瘤药物。本研究从分子水平上,利用基因表达谱在流动状态下与芯片杂交得到的扫描结果中,探针荧光背景小,信噪比高,并且阳性探针的信号强度强,而相同浓度的杂交样品采用传统的杂交法得到的杂
4
流动与芯片阵列发生接触,整个是一个随机化的杂交过程,同时样品在阵列表其次利用表达谱芯片研究青蒿素作用前后细胞基因表达的改变。体外出现皱缩及胞膜起泡等现象,部分细胞胞膜破裂,对细胞计数的结果发现,青蒿素作用后细胞生长相对于正常对照组受到一定程度的抑制。然后分别提取药标记对照样品,昙谴硌罚吩诹鞫掠階基因表达谱芯片进行杂交,然后结合质控探针的荧光信号值,平衡芯片的信号强度,再以探针信号的作为判断标准,筛选得到差异表达基因觯τ壬镅砑猩镅Х掷嗪凸δ芊治觯渲猩系骰蛑饕7治@胱转运,凋亡诱导,信号转导和蛋白酶解等类别,而下调基因中则包括了蛋白合成,肿瘤抑制,细胞分化和翻译调控等类别。进一步分析差异表达基因,发现电压依赖性桓评胱油ǖ繡和桓评胱油ǖ繡虻谋泶锼均显著上调,提示青蒿素有可能通过作用细胞膜上的离子通道,使细胞内钙离子的浓度升高,同时钾离子通道蛋白虮泶锼较碌鳎啬诹鞯囊制可以下降跨膜电位,激活促凋亡物质的释放,诱导细胞发生凋亡。同时,铁离子代谢相关基因的表达水平并没有明显改变,提示铁离子并不直接参与青蒿的裂解过程。同时,与细胞增殖相关的基因没有出现表达水平的改变,提示青亡的主要机制。硕士学位论文面的分布不受液体表面张力的影响,使反应更充分,杂交后得到的数据更具科学性。应用药物浓度//那