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学号:2009107057 单位代码:10759

石河子大学
硕士学位论文

双抗 CMV、ToMV 转基因烟草的研究

学位申请人田桂英
向本春教授
指导教师
郑银英副教授
申请学位门类级别农学硕士
学科、专业名称植物病理学
研究方向植物病毒及病毒病害
所在学院农学院

中国〃新疆〃石河子
2012 年 6 月
The Studies on Transgenic o of Doule Anti-CMV and
ToMV

A Dissertation Submitted to
Shihezi University
In Partial Fulfillment of the Requirements
For the Degree of
Master of Agriculture

By
Tian Guiying
(Plant Pathology)

Dissertation supervisor: Benchun
Associate Yinying

June,2012
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研究生签名: 时间: 年月日

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研究生签名: 时间: 年月日
导师签名: 时间: 年月日
摘要
黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)是严重危害农作物的病毒之一。番茄花
叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)常常与此种病毒复合侵染加工番茄,引起加工番茄条
斑坏死病毒病。近年来加工番茄病毒病在新疆发生越来越严重,严重影响了加工番茄的
品质和产量,造成较大的经济损失。对此,如何控制加工番茄上病毒病的发生与危害是
当前生产上迫切需要解决的问题。
一直以来,抗病毒病育种都是消除植物病毒病威胁的主要策略,但传统的育种方法
具有艰苦费时等局限性,从而限制了育种工作更快更深入地发展。近20年来植物抗病毒
基因工程的技术路线已日趋成熟,尤其近年来,RNAi技术的出现为植物抗病毒育种提
供了一条新的途径。
本研究采用 RNAi 技术,降解靶基因 mRNA,抑制 CMV 和 ToMV 内源靶基因的表
达,从而达到双抗 CMV 和 ToMV 的目的。
第一步,构建双抗 CMV 和 ToMV 的植物表达载体:
1. CMV 干扰片段的 RT-PCR 扩增:根据 CMV NS0-4 分离物设计合成特异性引物(在
上游引物引入 BamHⅠ酶切位点,在下游引物引入 KpnⅠ酶切位点),以 CMV NS0-4 为
模板,分别扩增出 CMV MP 和复制酶蛋白部分基因序列,记为 CR4、CR9、CR12、CR14,
将扩增片段克隆到 pGEM-Teasy,获得重组克隆 pGEM-T-CR。
2. ToMV 干扰片段的 RT-PCR 扩增:根据 ToMV SCS-2 分离物设计合成特异性引物
(在上游引物引入 SacⅠ和 BamHⅠ酶切位点,在下游引物引入 BglⅡ酶切位点),以
ToMV SCS-2 为模板,分别扩增出 ToMV 复制酶编的蛋白部分基因序列,记为 To4、To9、
To12、To14,将扩增片段克隆到 pGEM-Teasy,获得重组克隆 pGEM-T-To。
3. 两干扰片段的融合:用 BamHⅠ/PstⅠ从重组载体 pGEM-T-CR 切下 CR 片段,插
入用 BglⅡ/PstⅠ酶切的 pGEM-T-To,即构成重组质粒 pGEM-T-TC4、pGEM-T-TC9、
pGEM-T-TC12 和 pGEM-T-TC14。
4. 中间载体的构建: 分别用 BamH Ⅰ/Kpn Ⅰ