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学号:2009107061 单位代码:10759
石河子大学
硕士学位论文
dsRNA 介导的转基因加工番茄抗 CMV 研究
学位申请人刘炜炜
指导教师黄家风教授
申请学位门类级别农学硕士
学科、专业名称植物病理学
研究方向植物病毒及病毒病害
所在学院农学院
中国·新疆·石河子
2012 年 6 月
DsRNA-mediated Resistance to Cucumber mosaic virus (CMV) in
Transgenic Processing Tomato Plants
A Dissertation Submitted to
Shihezi University
In Partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of
Master of Agriculture
By
Liu Weiwei
(Plant Virology)
Dissertation Supervisor: Associate Professor Huang Jiafeng
June,2012
石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明
学位论文独创性声明
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示谢意。
研究生签名: 时间: 年月日
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研究生签名: 时间: 年月日
导师签名: 时间: 年月日
摘要
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是一种寄主范围非常广范的植物病毒,
是造成新疆加工番茄坏死条斑病的重要因素,严重影响加工番茄的品质和产量。利用基
因工程原理将病毒本身的一些基因转化到植物基因组中获得抗性植株是当前病毒病防
治的主要途径。本文的主要研究内容与结果如下:
CMV 复制酶基因和 2b 基因设计特异性引物,从石河子实验站采集表
现严重花叶症状的加工番茄,利用 RT-PCR 分别扩增两个片段,克隆并测序。其中 CMV
复制酶基因为 1627 位核苷酸开始的 546 个核酸片段,同源性比较表明,它与已报道的
AJ319666 的同源性最高,为 %;扩增得到的 2b 基因全长 336 个核苷酸,编码 111
个氨基酸。序列比对表明,扩增得到的 CMV 2b 基因与已报道 2b 基因 DQ873567 的核
苷酸序列同源性最高,达 %,与其氨基酸相似性达到 %。
Rep基因和CMV 2b基因的序列设计特异引物,通过PCR扩增到
CMV 379 bp △ Rep基因片段和 336 bp 2b 基因片段。然后将2个目的基因片段分别以反
向重复的方式与大豆内含子相连,得到含有目的基因片段反向重复序列的重组质粒
pBlue SK-Intron △ Rep (i/r)和pBlue SK-Intron 2b (i/r)。再用限制性内切酶切下包含Intron
在内的反向重复的目的基因片段,并定向插入到植物表达载体pBIN438上,分别构建成
功含CMV 基因的植物表达载体pBIN438△ Rep (i/r)和pBIN4382b (i/r)。酶切和PCR鉴定
证明所构建的载体与预期的设计完全一致。
87-5 和亚心 98-1 两个加工番茄栽培品种的离体再生体系的研究,
结果表明,激素的种类和浓度对加工番茄外植体出愈率的影响没有差异,但是诱导形成
的愈伤组织形态和不定芽存在差异,ZT 与 IAA 组合对不定芽的诱导效果高于 6-BA 与
IAA 组合,不定芽诱导率最高的培养基组合为 MS+/ L+/ L。并且品种
之间存在差异,亚心 98-1 比里格尔 87-5 更易产生较高比率的正常芽。再生芽在 1/2 MS