文档介绍：沉淀实验——双向琼脂扩散实验内容提要: 利用双向琼脂扩散试验测定不同浓度的鸡传染性法氏囊病病毒抗原药物扩散速率,观察实验结果并且总结关键词: 双向琼脂扩散试验琼脂凝胶配制制板打孔封底加样稀释抗原响因素引言: 目的:掌握双向琼脂扩散试验的基本操作和临床应用。实验原理: 琼脂的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移, 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀, 沉淀的产生组织抗原抗体复合物的自由运动, 沉淀带行程一种特异性的半渗透性屏障,阻滞相同抗原抗体复合物,而允许不同的分子通过。实验仪器和药品: Nacl 、蒸馏水、琼脂粉、电炉、平皿、硫柳汞、打孔器、电子秤、酒精灯、微量移液器、微量反应板、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清( 兽药生字( 2007 ) 150138086 青岛易邦生物工程有限公司) 、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原(兽药生字( 2007 ) 150138086 青岛易邦生物工程有限公司)。实验内容及步骤: 1. 琼脂凝胶的配制:取 8g Nacl 溶解于 100ml 蒸馏水中, 加优质琼脂粉 1g, 电炉缓慢加热使之彻底融化。 2. 制板:将清洁的平皿置于水平桌面上,每个平皿分别倒入加热融化的 1% 琼脂约 10ml , 使其厚度大约为 3mm , 注意切勿产生气泡。置于 4℃保存( 需保存较长时间时加入 1% 硫柳汞 1ml ) 3. 打孔:冷凝后打孔,打孔器内径约 3mm 。按图 1 在固定的位置用打孔器垂直打孔, 用7 号针头挑去孔中琼脂。 4 .封底:将琼脂平板置于酒精灯上微微加热,使孔底琼脂微融而封住孔底。 5. 加样: 用微量移液器在中央孔加入已知的诊断抗原, 外周孔加入待检血清,图2。置于 37℃培养箱中反应 24h ,观察实验。注: (加样至孔满为止,不可外溢。待孔内液体渗入凝胶后即可放入温盒中。温盒约 37℃,一般保存 24-48h ,观察抗原抗体产生的沉淀线) 稀释抗原:将①里接入 80ul 抗原,将②--⑤接入 40ul 生理盐水,用移液枪吸取 40ul ①溶液,移入②中,混匀,然后从②吸取 40ul 溶液移入③中,混匀,然后从③吸取 40ul 溶液移入④中,混匀,然后从④吸取 40ul 溶液移入⑤中,混匀, ⑥放入生理盐水 40ul 。实验结果与分析: 观察孔间沉淀线的数目与特征,一般可注意到以下几种现象: 1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线, 说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合,如出现数条沉淀线,说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合 2 、根据抗原的成份可有以下三种现象: 1 )若二孔中的抗原相同,与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形;(2) 若二孔中抗原不同, 当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时, 则形成的沉淀线相交叉;(3) 若两孔中抗原部分相同,抗血清中有各相应的抗体,形成的沉淀线相切。 3、相应抗原抗体所形成的沉淀线, 如二者浓度相当, 沉淀线在孔中央, 二者浓度不当时,则沉淀线偏向浓度低的一侧[1] 图3 和图 4中①是鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清。②是鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原原液。③是 1/2 鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原④ 1/4 鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原⑤ 1/8 鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原⑥ 1/16 鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩