文档介绍：第七章蛋白质翻译后修饰的鉴定第一节磷酸化蛋白质的鉴定大部分细胞过程是被可逆的蛋白磷酸化所调控,至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。一、蛋白质磷酸化修饰及其功能磷酸化几乎涉及所有的生理及病理过程,如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、及细胞的增殖、发育和分化等。1992nobelprizewinnerFisher&Krebs磷酸化位点真核生物一般是O-磷酸化,主要在Ser、Thr、Tyr三个位点上发生磷酸化;原核生物一般是O-磷酸化,位点通常在His、Asp、Glu上。磷酸化蛋白质组研究的难点1)磷酸化蛋白质含量少,化学计量值低,磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中;2)磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制,磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化肽段的信号强度要低很多;3)磷酰键较肽键容易断裂,使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鉴定困难得多;4)体内的磷酸化状态是动态的(丰度、形式多样)。二、磷酸化蛋白质检测1、放射性同位素标记法体内代谢培养用32P标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被32P标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。缺点:同位素污染2、免疫印记和免疫沉淀通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应(Westernblotting)来检出磷酸化蛋白质。3、蛋白质磷酸化位点分析磷酸化蛋白质检测蛋白质磷酸化位点和数目?磷酸肽的分离和富集磷酸肽的识别和位点确定难点:化学计量低;难电离;非磷酸化肽抑制其信号磷酸肽的分离和富集常用的金属离子:Fe3+、Ga3+、Cu2+